Enzygnost HIV Integral

Enzygnost® HIV Integral
Enzyme immunoassay for the qualitative detection of HIV infection based on
the determination of HIV p24 antigen, antibodies to human immunodeficiency
virus of types 1 and 2 (HIV 1 and HIV 2), as well as against antibodies to HIV 1,
subtype O, in serum and plasma.
Enzymimmunoassay zum qualitativen Nachweis einer HIV Infektion basierend
auf der Bestimmung von HIV p24-Antigen, Antikörpern gegen die humanen Im-
mundefizienz Viren der Klasse 1 und 2 (HIV 1 und HIV 2), sowie Antikörpern
gegen das HIV 1-Subtyp O-Virus in Serum und Plasma.
Test immunoenzymatique pour la mise en évidence qualitative d’une infection à
VIH, basée sur la détection de l’antigène VIH p24, des anticorps anti-virus de
l’immunodéficience humaine des classes 1 et 2 (VIH 1 et VIH 2), ainsi que des
anticorps anti-VIH 1 sous-type O, dans le sérum ou le plasma.
Metodo immunoenzimatico per l'identificazione qualitativa di una infezione HIV,
basata sulla determinazione dell'antigene HIV p24, degli anticorpi contro il vi-
rus dell'immunodeficienza umana del tipo 1 e 2 (HIV 1 e HIV 2) e degli anticorpi
anti-HIV1 sottotipo O, nel siero e nel plasma.
Ensayo inmunoenzimático para el reconocimiento cualitativo de una infección por
HIV, basado en la determinación del antígeno HIV-p24, de los anticuerpos contra
los virus de la inmunodeficiencia humana de la clase 1 y 2 (HIV 1 y HIV 2), así como
también, de los anticuerpos contra el virus HIV 1-subtipo O en suero y plasma.
O Enzygnost® HIV Integral é um teste imunoenzimático para detecção qualitativa
de infecção pelo HIV, com base na determinação do antigéneo HIV p24, de anti-
corpos contra os vírus da imunodeficiência humana das classes 1 e 2 (HIV 1 e
HIV 2) e de anticorpos contra o vírus HIV 1 - subtipo O, no soro e no plasma.



English:                                   Page       2   to      10
Deutsch:                                   Seite     11   bis     19
Français:                                  Pages     20   à       28
Italiano:                                  Pagina    29   fino    37
Español:                                   Página    38   hasta   47
Português:                                 Páginas   48   a       56


Summary of Test Procedure                  Page             10
Kurzanleitung Testdurchführung             Seite            19
La technique en bref                       Page             28
Istruzioni in breve, esecuzione del Test   Pagina           37
Resumen de la técnica                      Página           47
Resumo da técnica                          Página           56


Bibliography/Literatur/Littérature
Bibliografía/Bibliografia                  Page/Seite/Página/Pagina    57



OQTO G11 C0541 (1584) H   1                                                 Edition October 2003
Enzygnost® HIV Integral
Intended Use and Application
Enzyme immunoassay for the qualitative detection of HIV infection based on the determination of
HIV p24 antigen, antibodies to human immunodeficiency virus of types 1 and 2 (HIV 1 and HIV 2), as
well as against antibodies to HIV 1, subtype O, in serum and plasma. The enzyme immunoassay is
processed on the BEP® II, BEP® III and BEP® 2000 ELISA processors. The test was developed for testing
single samples and not pooled or diluted samples. The product is for in vitro diagnostic use only.
Summary and Explanation
Acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) was first recognized in 1981 as a clinical picture in
its own right. The disease is today considered to involve two different Human Immunodeficiency
Viruses (HIV 1 and HIV 2) as causal agents. The HIV 1 virus (synonym: LAV/HTLV-III) was
isolated as early as in 1983 (1,2) and a further such pathogenic human virus (HIV 2) was isolated
in 1986 (3). A high level of importance is attached to the serological determination of antibodies
to HIV, especially in the field of transfusion medicine where measures are needed to prevent the
further spread of the disease.
Consequently, from 1985 onwards, donor blood was screened for HIV 1 antibodies on a manda-
tory basis, both by blood banks and manufacturers of plasma products. Subsequent information
on the spread of HIV 2 infections revealed that blood donors need to be tested routinely not only
for anti-HIV 1 antibodies but also for anti-HIV 2 in order to exclude to the greatest possible extent
the potential risk of transmission via blood transfusions or blood-derived products.
In 1990 a new type of HIV virus was reported which at first was considered to be serologically of
little significance (4). It was not until 1994 that two independent teams succeeded, simultaneous-
ly, in sequencing this new subtype (5,6). Parallel to this virological research, several teams were
able to demonstrate the serological significance of the virus, now known as HIV 1 subtype O
(7,8). This research showed that a multitude of anti-HIV 1+2 assays exhibit weaknesses in de-
tecting subtype O antibodies (9). Consequently, a need arose for reliable concurrent detection of
this new HIV variant along with the established HIV 1 and HIV 2 isolates.
In some HIV seroconversion samples HIV p24 antigen was detected before the detection of HIV
antibodies. To narrow the diagnostic window between the occurrence of HIV infection and its first
serological detection it was therefore desirable to supplement the antibody test with a test for
HIV p24 antigen.
Although the determination of HIV antibodies and/or antigen does not allow definite conclusions
to be made on whether infectious HIV 1 or HIV 2 is present in the blood at the time of blood
collection, in the same way that a negative result does not exclude the presence of HIV 1 or HIV
2 with certainty, currently the combined antigen/antibody test provides the best means of detec-
ting and eliminating blood donations from HIV-infected donors with a high level of probability.
Principle of the Method
Enzygnost® HIV Integral is an enzyme immunoassay based on the simultaneous determination
of HIV antigen and HIV antibody.
In the first step, the HIV immunoglobulin in the test sample reacts with the recombinant proteins/
synthetic peptides of HIV 1, HIV 2 and HIV 1 (subtype O) that are coated onto the wells of the
microtitre plate.
Simultaneously, any HIV p24 antigens present in the test sample can bind to the polyclonal HIV
p24 antibodies attached to the wells.
The unbound sample constituents are removed by washing and then, in the second step, the
specifically bound antibodies are labelled (antigen sandwich) with biotin-conjugated recombi-
nant proteins/synthetic peptides of HIV 1, HIV 2 and/or HIV 1 (subtype O). Simultaneously, any
bound HIV antigens are labelled by biotin-conjugated monoclonal HIV p24 antibodies (antibody
sandwich).
The unbound biotin conjugates are then removed by washing and then, in the third step, Conju-
gate 2 (streptavidin/POD) reacts with the biotin conjugates specifically bound to the solid phase.
The excess Conjugate 2 is then removed and the enzyme activity of the bound conjugate deter-
mined (blue colour reaction). The enzymatic conversion of the chromogen is terminated by the
addition of Stopping Solution POD (yellow colour reaction). The colour intensity is proportional to
the concentration of HIV p24 antigen and HIV antibody present in the sample.

OQTO G11 C0541 (1584) H   2                                                    Edition October 2003
Reagents
Material provided
                                               2 x 96                   10 x 96
Enzygnost® HIV Integral:                       2 test plates            10 test plates
HIV Conjugate 1:                               2 x 1 vial               10 x 1 vial
HIV Conjugate Buffer 1:                        2 x 15 mL                10 x 15 mL
HIV Conjugate 2:                               2 x 15 mL                10 x 15 mL
HIV Sample Buffer:                             2 x 15 mL                4 x 15 mL
HIV Control, positive:                         2 x 1.4 mL               3 x 1.4 mL
HIV Control, negative:                         2 x 2.0 mL               3 x 2.0 mL
Label "Empty bottle for for HIV Conjugate 1"   -                        1 pcs.
Label "Empty bottle for HIV Conjugate 2"       -                        1 pcs.
Package insert                                 1 pcs.                   1 pcs.
Barcode table of values                        1 pcs.                   1 pcs.
PE bag                                         1 pcs.                   1 pcs.
Additional materials required, but not provided, for the 2 x 96 and 10 x 96 kits:
Supplementary Reagents for Enzygnost® TMB (Order No. OUVP)
Composition
Enzygnost® HIV Integral test plate
Microtitre plate coated with a mixture of recombinant proteins (E. coli) and synthetic peptides
from HIV 1 gp41, HIV 1 (subtype O) gp41, HIV 2 gp36, as well as polyclonal antibodies (rabbit)
to HIV p24.
HIV Conjugate 1
Lyophilized substance consisting of recombinant HIV proteins (E. coli) / synthetic peptides of
HIV 1, HIV 2 and HIV 1 (subtype O) as well as monoclonal antibodies (mouse) to HIV p24, biotin-
conjugated; coloured blue.
Reconstitute with 15 mL of HIV Conjugate Buffer 1.
HIV Conjugate Buffer 1
Tris buffer containing Sapogenat* and casein; coloured yellow.
Preservative: phenol (max. 1 g/L)
HIV Conjugate 2
Tris Buffer containing Sapogenat* and streptavidin, peroxidase (POD)-conjugated; coloured red.
Preservative: phenol (max. 1 g/L)
HIV Sample Buffer
Phosphate buffer containing casein and Triton X 100*; coloured red.
Preservative: phenol (max. 1 g/L)
HIV Control, positive
Heat-treated human serum containing antibodies to HIV 1 antigens, stabilized.
Nominal absorbance: ≥ 0.7
Preservative: phenol (max. 1 g/L)
HIV Control, negative
Human serum without HIV antigen and without antibodies to HIV 1, HIV 2, and HIV 1 (subtype O)
antigens, stabilized.
Nominal absorbance: ≤ 0.15
Preservative: phenol (max. 1 g/L)
Warnings and Precautions
1. For in vitro diagnostic use.
2. Each individual blood donation for use in the manufacture of the control sera is tested for
   HBsAg, anti-HCV, anti-HIV 1 and anti-HIV 2. Only sera with negative findings are used for
   manufacturing the negative control serum. The positive control serum is heat-treated (not
   less than 1 hour at +56 °C).
OQTO G11 C0541 (1584) H   3
Nevertheless, since absence of infectious agents cannot be proven, all materials obtained
   from human blood should be handled with due care, observing the precautions recommen-
   ded for biohazardous material (10).
3. It is advisable to wear protective gloves throughout the entire test procedure.
4. Prior to disposal, it is recommended that solid infectious materials should be autoclaved for at
   least one hour at +121 °C. All aspirated solutions should be collected in two receptacles
   connected in series. These should both contain a disinfectant suitable for inactivating patho-
   genic human viruses. The concentrations and reaction times specified by the manufacturer
   must be observed.
Preparation of the Reagents
Bring all the reagents and samples to +15 to +25 °C before beginning the test (without removing
the test plate from the container).
Test strips not needed for the test must be removed from the holder and stored for later use (see
Table 1).
The 10 x 96 pack of Enzygnost® HIV Integral is supplied with one barcoded label for the HIV
Conjugate 1 as well as one for the HIV Conjugate 2. When processing large series of samples on
the BEP® III, a frequent change of syringe can be avoided by pooling several conjugate vials in a
larger bottle (e.g. surplus, unused empty bottles for the Working Chromogen Solution, see Mate-
rials required but not provided), and then labelling this vial with the respective label ("Empty
bottle for Conjugate ..."). This labelled bottle is then placed into the reagent rotor.
For each test plate, dilute 20 mL of Washing Solution POD (Supplementary Reagents Kit)
to 400 mL with distilled or deionized water.
For each test plate, dilute 1 mL of Chromogen TMB with 10 mL of Buffer/Substrate TMB
(Supplementary Reagents Kit) in the empty bottle supplied with the kit (= Working Chromogen
Solution) and store closed and protected from light. After use rinse the bottle thoroughly with
distilled water.
For technical reasons (overage) it is not permissible to transfer the contents of the Chromogen
TMB vial into the vial of Buffer/Substrate TMB.
HIV Conjugate 1 solution: Transfer the entire contents of a vial of HIV Conjugate Buffer 1 (15 mL,
coloured yellow) into a vial of HIV Conjugate 1 (lyophilized material, coloured blue). Swirl gently to
completely dissolve the lyophilized material. The HIV Conjugate 1 solution then has a green colour.
Before use allow the HIV Conjugate 1 solution to equilibrate for at least 15 minutes.
Storage and Stability
Stored unopened at +2 to +8 °C, all components of the Enzygnost® HIV Integral kit may be used
up to the dates of expiry given on the labels.
Once opened, the details given in Table 1 in the Appendix apply.

Equipment required:
BEP® II:              For automatic dispensing of reagent and washing
BEP® III:             For automatic processing of the test after dispensing the samples as well
                      as for evaluation
BEP® 2000:            For fully automatic processing and evaluation of the test
Pipettes:             piston-type pipettes 25, 100 and 1000 µL
Incubator:            Covered water bath (+37 ± 1 °C) or comparable incubation methods
All the equipment used in the test must have been validated.
Specimens
Suitable specimens are individual samples (human sera or EDTA/heparinized/citrated plasma)
obtained by standard laboratory techniques. The samples should be stored for not more than 3
days at +2 to +8 °C. If the samples are to be stored for a longer period of time, they must be
frozen.




OQTO G11 C0541 (1584) H   4
Method
Test procedure using the BEP® II
 1.Assay scheme: Ascertain the number of wells required (= number of test samples plus 5
    wells for the controls).
 2.Dispense sample buffer: Introduce 25 µL of sample buffer into each well.
 3.Dispense samples: Into 3 wells (A1 to C1) pipette 100 µL/well of the HIV Control, negative,
    and into 1 well (D1) pipette 100 µL of the HIV Control, positive. Fill each of the subsequent
    wells with 100 µL/well of undiluted sample. At the end of the series/plate, fill one further well
    with 100 µL of HIV Control, positive.
    Alternatively, the HIV Control, positive, can be pipetted in duplicate at the start of the series:
    Alternative: Into 3 wells (A 1 to C1) pipette 100 µL/well of HIV Control, negative, and into 2
    wells (D1 and E1) pipette 100 µL/well of HIV Control, positive. Then fill the subsequent wells
    with 100 µL/well of undiluted sample.
    Perform the pipetting steps within 30 min per test plate.
 4.Incubate: Cover the test plate with adhesive foil and incubate at 37 ± 1 °C for 30 ± 2 minutes,
    then proceed immediately to the washing step.
 5.Wash: Remove the foil, aspirate all the wells and wash 4 times with approx. 0.3 mL/well of
    washing solution.
 6.Dispense HIV Conjugate 1 solution: Fill each well with 100 µL of HIV Conjugate 1 solution,
    cover with fresh adhesive foil and immediately place in the incubator.
 7.Incubate: At 37 ± 1 °C for 30 ± 2 min as described in 4.. Then proceed immediately to the
    next washing step.
 8.Wash: Remove foil and wash 4 times as described in 5..
 9.Dispense HIV Conjugate 2: Fill each well with 100 µL of HIV Conjugate 2, then cover with
    fresh adhesive foil and place immediately in the incubator.
10.Incubate: At 37 ± 1 °C for 30 ± 2 min as described in 4.. Then proceed immediately to the
    next washing step.
11. Wash: Remove the foil and wash 4 times as described in 5..
12.Dispense substrate: Fill each well with 75 µL of the Working Chromogen Solution.
13.Incubate: Cover with fresh adhesive foil and incubate at +15 to +25 °C for 30 ± 2 min protec-
    ted from light.
14.Stop reaction: Remove the foil, then add 75 µL of Stopping Solution POD to each well,
    keeping to the same timing as in Step 12.
15.Read: Read at 450 nm within one hour. The recommended wavelength for the reference
    measurement is 650 nm (where appropriate, between 615 and 690 nm).
Test procedure using the BEP® III
Before using the BEP® III, prepare the test plates and sample dispensing steps (Section 1 and 2
at "Test procedure using the BEP® II"). Immediately afterwards place the uncovered test plates
(i.e. not covered with adhesive foil) into the BEP® III. Note that partially filled test plates need to
be made up to at least half plates (6 test strips) by adding "water-filled strips". The test is then
processed fully automatically (see BEP® III instruction manual).
The settings for the incubation times in the BEP® III software may differ from the times on the BEP®
II for technical reasons (system speed) but have been validated for Enzygnost® on the BEP® III.
Test procedure using the BEP® 2000
The sample dispensing steps and subsequent processing steps in the test are performed fully
automatically in the instrument (see instruction manual for the BEP® 2000).
Validation of the test
The individual absorbance readings for the control sera are used for calculating the mean values if:

-0.010 ≤ Aneg. ≤ 0.150
         Apos. ≥ 0.700



OQTO G11 C0541 (1584) H   5
If one of the three absorbance values of the negative control is outside the specification, this
value can be neglected.
Both absorbance values of the positive control must comply with the specification.
If these specifications are not fulfilled, the test must be repeated.
Evaluation of the test
On the BEP® 2000 and BEP® III the results are evaluated automatically. Please consult the in-
struction manuals for further details in this respect. The following sections apply if the results are
evaluated without software assistance.
Calculate the mean absorbance of the negative controls, then calculate the cut-off limit by ad-
ding 0.450:
           –
Cut -off = Aneg. + 0.450

The retest range is defined as follows:
Cut-off to Cut-off - 0.05

The test samples are classed as follows based on the criteria of the test:
Result:
1.        Asample < cut-off - 0.05 = "negative"
2.        Asample > cut-off        = "reactive"
3.        cut-off - 0.05 ≤ Asample ≤ cut-off = "equivocal"
Samples with absorbances within or above the retest range must be retested in duplicate. If, in
the retest, an initially reactive sample yields absorbances which are both below the retest range,
the sample is classed negative based on the criteria of the test.
If at least one of the two absorbances in the retest is again within or above the retest range the
sample is classed as repeatedly reactive. It is essential that all repeatedly reactive samples
should be verified using a confirmatory test (e.g. Immunoblot, Nucleic acid analysis). To be on
the safe side, a follow-up sample should be tested (about 2 weeks later).
Limitations and Interferences
 1.Anticoagulants such as heparin, EDTA and citrate do not interfere with the test.
 2.Samples that are haemolytic or icteric do not interfere with the test.
 3.Samples containing the potential interference factors ANA, E.-Coli and EBV antibodies, as
   well as sera from pregnant women, were checked in the test. The samples used were found
   not to interfere with the results.
 4.No interferences were observed with heat-treated samples (30 min, 56 °C).
 5.Serum from insufficiently coagulated blood, and samples which contain microbial contamina-
   tion, should not be used. Any particulate components in the sample (e.g. fibrin clots, erythro-
   cytes) should be removed before the test.
 6.Lipaemic, rheumatoid factors and AMA containing samples, as well as samples with HAV
   antibodies may lead to a higher reactivity.
 7.Enzygnost® HIV Integral is a test for the simultaneous detection of HIV p24 antigen and HIV
   antibodies, and must not be used for the sole detection of HIV p24 antigen.
 8.When using thawed samples, ensure good homogenization of the material prior to use.
 9.The pack contains a matched set of reagents. Reagents must not be interchanged with other
   kits unless the reagents are from an identical lot (i.e. they must display the required 6-digit lot
   numbers printed on the pack and given in the enclosed barcode table of values). Washing
   Solution POD, Stopping Solution POD and Working Chromogen Solution are exceptions to
   this requirement. Note that the Working Chromogen Solution must first be prepared from
   matched components (do not use Chromogen TMB and Buffer/Substrat TMB from kits with a
   different number).




OQTO G11 C0541 (1584) H    6
10.Buffer/Substrate TMB, the Working Chromogen Solution and the Stopping Solution POD
   must not be allowed to come into contact with heavy metal ions or oxidizing substances (do
   not use pipettes with metal parts in contact with the liquid!). Do not perform the substrate
   reaction in the proximity of disinfectants containing hypochlorite. If the Working Chromogen
   Solution has spontaneously developed a blue colour before transferral into the test plate, this
   indicates that the solution is contaminated; in such cases prepare a fresh solution in a clean
   container. Skin contact with the above-mentioned solutions is to be avoided.
11.The test plate should be protected from vibration during the incubation phase (e.g. placed on
   a secured floatation aid, or in a non-circulating water bath); the wells of the plate must be in
   contact with the thermostatted water. If stabilizers are used to prevent microbial contaminati-
   on of the water, care must be taken that neither the surface of the test plate nor the wells
   come into contact with these solutions since such contamination can lead to unspecific reac-
   tions.
12.With highly reactive samples the dye may precipitate during the stopping reaction. This does
   not interfere with the photometric evaluation.
13.The control sera have been prepared from native human sera. As a result, turbidity may occur
   but this has no effect on the test result.
14.Do not expose the test plate to direct sunlight for an extended period of time before beginning
   the test.
Specific Performance Characteristics
Sensitivity and Specificity
The results of the sensitivity and specificity studies are shown in Tables 2 + 3 (Appendix). The
sensitivity of the test was established by investigating a total of 515 anti-HIV 1, 164 anti-HIV 2, 26
anti-HIV 1 (subtype O) and 64 HIV antigen positive samples. All the tested HIV antigen/antibody
positive samples were found to be positive according to the criteria of Enzygnost® HIV Integral.
The reactivity of the test in respect to seroconversion samples was investigated using 34 sero-
conversion panels. Here, Enzygnost® HIV Integral was found to detect seroconversion with
greater sensitivity than tests that detect only HIV antibody. Nevertheless, when the test is used
on a wide scale it is not possible to rule out that some samples may escape detection.
When the SFTS Panel was tested (1996), the sample with a declared value of 250 pg HIV
antigen/ml (No. 2024) was found to be reproducibly positive. By testing the dilution steps of the
SFTS Panel for both the 100 pg sample and the sample with a declared value of 250 pg HIV
antigen/ml, an analytical sensitivity between 100 and 250 pg HIV antigen/ml was calculated.
The specificity of the test was established by investigating a total of 8851 HIV-negative blood
samples. The specificity results obtained were 99.3 % to 99.95 % (initial testing) and 99.7 % to
100 % (retest). Deviations are possible depending on the sample population, test procedure and
other factors.
Current knowledge indicates that a positive result in the test does not yield definite evidence that
the blood contains infectious HIV 1 or HIV 2, just as a negative result also does not definitely
exclude the presence of HIV 1 or HIV 2.
Reproducibility
The results of the intra-/inter-assay reproducibility study are listed in Table 4 (in the Appendix).
These are exemplary data. Deviations from the values are quite possible depending on procedu-
re and other factors.

Enzygnost and BEP are registered trademarks of Dade Behring Marburg GmbH in the USA,
Germany and other countries.
*Sapogenat is a trademark of Clariant. Triton 100 X is a trademark of Merck.




                                                                           0197
        Dade Behring Marburg GmbH
        Emil-von-Behring-Str. 76
        D-35041 Marburg
        www.dadebehring.com




OQTO G11 C0541 (1584) H   7
Tab. 1 Storage and Stability

    Material/Reagent                  State                Storage              Stability*

    Enzygnost® HIV Integral test plate once opened         +2 to +8 °C in the   4 weeks
                                                           bag with the
                                                           desiccant

    HIV Conjugate 1                   once                 +2 to +8 °C          4 weeks
                                      reconstituted        +15 to +25 °C        2 days

    HIV Conjugate 2                   once opened          +2 to +8 °C          4 weeks
                                                           +15 to +25 °C        2 days

    HIV Sample Buffer                 once opened          +2 to +8 °C          4 weeks

    HIV Control, positive             once opened          +2 to +8 °C          4 weeks
                                                           -20 °C               3 months

    HIV Control, negative             once opened          +2 to +8 °C          4 weeks
                                                           -20 °C               3 months

    Chromogen TMB                     once opened          +2 to +8 °C          expiry date

    Buffer/Substrate TMB              once opened          +2 to +8 °C          expiry date

    Working Chromogen Solution        diluted              +2 to +8 °C          5 days
                                      1 + 10               +15 to +25 °C        8 hours
                                                           in closed container
                                                           protected from light

    Washing Solution POD              once opened          +2 to +8 °C          expiry date
    (concentrate)                     diluted 1:20         +2 to +8 °C          1 week
                                      diluted 1:20         +18 to +25 °C        1 day

    Stopping Solution POD             once opened          +2 to +8 °C          expiry date

*    use each component by the expiry date at the latest




OQTO G11 C0541 (1584) H     8
Tab. 2 Sensitivity
The sensitivity studies yielded the following data:

     Sample population             Number of samples                       Initially reactive
 Anti-HIV 1 pos.                           515                                   515
 Anti-HIV 2 pos.                           164                                   164
 Anti-HIV 1 (subtype O) pos.                26                                    26
 HIV antigen pos.                           64                                   64*

 Seroconversion panel                 34 HIV panels                   Greater sensitivity than
                                                                      with HIV antibody tests
* With early seroconversion samples, HIV p24 antigen tests show better sensitivity for the de-
  tection of HIV antigen.

Tab. 3 Specificity
The specificity studies yielded the following data:

  Sample population Number of samples                 Initially reactive         Retest active
  Negative sera (A)            4002                          9                            8
  Negative sera (B)            2135                          1                            0
  Negative sera (C)            2370                          17                           7
  Neg. plasmas (D)             344                           1                            1

Tab. 4 Reproducibility
In the studies on intra-assay reproducibility the samples were tested in 8-fold replicates on each
of 5 days. The coefficients of variation (CV’s) were calculated using the variance component
model.
                                                       Enzygnost® HIV Integral
     Sample                        Mean absorbance                                % CV
     P1                                  0.817                                      4.4
     P2                                  1.781                                      5.7
     P3                                  1.202                                      4.4
     P4                                  0.519                                      3.8

In the studies on inter-assay reproducibility the samples were tested in 8-fold replicates on each
of 5 days. The coefficients of variation (CV’s) were calculated using the variance component
model.
                                                       Enzygnost® HIV Integral
     Sample                        Mean absorbance                                % CV
     P1                                  0.817                                      12
     P2                                  1.781                                      5.9
     P3                                  1.202                                      2.3
     P4                                  0.519                                      4.1




OQTO G11 C0541 (1584) H   9
Tab. 5 Testprocedure and programming steps
                                   Enzygnost® HIV Integral
                   Testprocedure                                   Menuprogramming
            (BEP® II, BEP® III, BEP® 2000)                         for the
                          Prepare reagents            BEP® 2000
                                                                  BEP® II
                                                                        MENU NO
                     25 µL HIV Sample Buffer                            OPERATE 1          YES
                                                                        Dispense Sample Buffer
                   3 x 100 µL HIV Control, negative                     WASHINGS            0
                   1 x 100 µL HIV Control, positive                     ASPIRATE           NO
                    100 µL undiluted sample each                        SOAKTIME            0
                   1 x 100 µL HIV Control, positive                     DISP VOL            25
                                                                        CHANNEL NO          3
            BEP® II                              BEP® III               PHOT               NO
                                                                        OPERATE 2          YES
                                                                        Wash and dispense Conjugate 1
         30 min ± 2 min                in the case of partially filled
                                                                        WASHINGS            4
           (37 ± 1 °C)                   plates: Add "water-filled      ASPIRATE           NO
                                        strips" to half fill the plates SOAKTIME            0
            Wash 4 x:                                                   DISP VOL           100
                 ®
             BEP II                                                     CHANNEL NO          1
                                                                        PHOT               NO
100 µL HIV Conjugate 1 Solution                                         OPERATE 3          YES
                                                                        Wash and dispense Conjugate 2
         30 min ± 2 min                                                 WASHINGS            4
           (37 ± 1 °C)                                                  ASPIRATE           NO
                                                                        SOAKTIME            0
                                                 Fully auto-
                                              matic processing          DISP VOL           100
            Wash 4 x:
                                                                        CHANNEL NO          2
             BEP® II
                                                                        PHOT               NO
                                                                        OPERATE 4          YES
    100 µL HIV Conjugate 2                                              Wash and dispense chromogen
                                                                        WASHINGS            4
                                                                        ASPIRATE           NO
         30 min ± 2 min                                                 SOAKTIME            0
           (37 ± 1 °C)                                                  DISP VOL            75
                                                                        CHANNEL NO          4
                                                                        PHOT               NO
            Wash 4 x:
                                                                        OPERATE 5          YES
             BEP® II
                                                                        Dispense Stopping Solution
                                                                        WASHINGS            0
         75 µL Working                                                  ASPIRATE           NO
      Chromogen Solution                                                SOAKTIME            0
                                                                        DISP VOL            75
                                                                        CHANNEL NO          5
         30 min ± 2 min                                                 PHOT               YES
 (+15 to +25 °C, protected from light)                                  MEAS WL            450
                                                                        REF WL             650
                                                                        BLK COR            NO
    75 µL Stopping Solution                                             EVAL MODE           1
                                                                        GEN CUT            NO
                                                                        NEG CONT            3
         after max. 1 h                                                 MAX NEG           0.150
                                                                        MIN NEG              -
        Read at 450 nm                                                  FACT NEG             -
  (Reference wavelength: 650 nm)                                        MAX POS              -
                                                                        THRESH            0.450
           Test result                           Test result            CUT OFF              -


OQTO G11 C0541 (1584) H   10
Enzygnost® HIV Integral
Anwendungsbereich und -zweck
Enzymimmunoassay zum qualitativen Nachweis einer HIV Infektion basierend auf der Bestimmung
von HIV p24-Antigen, Antikörpern gegen die humanen Immundefizienz Viren der Klasse 1 und 2
(HIV 1 und HIV 2), sowie Antikörpern gegen das HIV 1-Subtyp O-Virus in Serum und Plasma. Die
Abarbeitung des Enzymimmunoassays erfolgt mit den ELISA Prozessoren BEP ® II, BEP® III und BEP® 2000.
Der Test wurde entwickelt für die Untersuchung von Einzelproben, nicht von gepoolten oder
verdünnten Proben. Das Produkt darf nur für in vitro diagnostische Zwecke angewendet werden.
Diagnostische Bedeutung
Das erworbene Immundefizienzsyndrom (AIDS) wurde erstmalig 1981 als eigenständiges
Krankheitsbild erkannt. Als ursächlicher Erreger gelten heute zwei verschiedene Human Im-
mundefizienz Viren (HIV 1 und HIV 2). Die Isolierung des HIV 1 (Synonym: LAV/HTLV III) gelang
bereits 1983 (1, 2). Im Jahre 1986 wurde ein weiteres Virus (HIV 2) isoliert, das ebenfalls als
humanpathogen gilt (3) . Die Bedeutung der serologischen Bestimmung von Antikörpern gegen
HIV hat besonders für die Transfusionsmedizin unter dem Gesichtspunkt der Prävention zur
Verhütung der weiteren Ausbreitung der Erkrankung einen hohen Stellenwert.
Folgerichtig wurde ab 1985 die Testung von Spenderblut auf Anti-HIV 1-Antikörper sowohl in
Blutbanken als auch bei Herstellern von Plasmaprodukten obligatorisch. Zwischenzeitliche In-
formationen über die Verbreitung von HIV 2-Infektionen ergaben das Bedürfnis einer routinemä-
ßigen Untersuchung von Blutspendern außer auf Anti-HIV 1- auch auf Anti-HIV 2-Antikörper, um
eine potentielle Übertragung durch Transfusion oder aus Blut hergestellten Präparaten nach
Möglichkeit auszuschließen.
Im Jahre 1990 wurde ein neuartiges HIV beschrieben, welches zunächst serologisch als wenig
relevant eingeordnet wurde (4). Erst 1994 gelang gleichzeitig die Sequenzierung dieses neuen
Subtyps bei zwei unabhängigen Arbeitsgruppen (5,6) . Parallel zu den virologischen Arbeiten
konnte von mehreren Arbeitsgruppen die serologische Bedeutung von dem nun als HIV 1- Sub-
typ O (7,8) genannten Virus gezeigt werden. Danach zeigen eine Vielzahl von Anti-HIV 1+2-
Assays Schwächen bei der Detektion von Anti-Subtyp O (9). Folgerichtig entstand der Bedarf
zum gleichzeitigen sicheren Nachweis dieser neuen HIV-Variante und den etablierten HIV 1-
und HIV 2-Isolaten.
Bei einigen HIV-Seroconversionen wurde HIV p24-Antigen nachgewiesen, bevor HIV-Antikörper
gefunden wurden. Um das diagnostische Fenster zwischen HIV-Infektion und dem ersten sero-
logischen Nachweis noch weiter zu schließen, war es daher sinnvoll, den Antikörpertest um eine
HIV p24-Antigen Erkennung zu erweitern.
Obwohl die Bestimmung von HIV-spezifischen Antikörpern und/oder Antigen keine sicheren
Aussagen darüber erlaubt, ob zum Zeitpunkt der Blutentnahme infektiöses HIV 1 bzw. HIV 2 im
Blut vorhanden ist , als auch bei negativem Ergebnis keineswegs die Anwesenheit von HIV 1
oder HIV 2 sicher ausgeschlossen werden kann, stellt der kombinierte Antigen-/Antikörpertest
dennoch die derzeit beste Möglichkeit dar, Blutspenden von HIV-Infizierten mit sehr großer
Wahrscheinlichkeit zu erkennen und zu eliminieren.
Prinzip der Methode
Enzygnost® HIV Integral ist ein Enzymimmunoassay, basierend auf der gleichzeitigen Bestim-
mung von HIV-Antigen und HIV-Antikörper.
Die in der Untersuchungsprobe vorhandenen HIV-spezifischen Immunglobuline reagieren im
ersten Schritt mit den in den Vertiefungen der Mikrotitrationsplatten fixierten HIV 1-, HIV 2- und/
oder HIV 1(Subtyp O)- rekombinanten Proteinen/ synthetischen Peptiden.
Simultan können in der Untersuchungsprobe vorhandene HIV-p24-Antigene an die fixierten po-
lyklonalen Anti-HIV-p24-Antikörper binden.
Nach Entfernung der ungebundenen Probenbestandteile werden im zweiten Schritt die spezi-
fisch gebundenen Antikörper durch Biotin-konjugierte HIV 1-, HIV 2- und /oder HIV 1 (Subtyp O)-
rekombinante Proteine / synthetische Peptide markiert (Antigen-Sandwich). Simultan werden
gebundene HIV-Antigene durch Biotin-konjugierte monoklonale HIV-p24-Antikörper markiert
(Antikörper -Sandwich).



OQTO G11 C0541 (1584) H   11                                                  Ausgabe Oktober 2003
Nach Entfernung der ungebundenen Biotin-Konjugate reagiert im dritten Schritt das Konjugat 2
(Streptavidin/POD) mit den spezifischen an die Festphase gebundenen Biotin-Konjugaten.
Nach Entfernung des überschüssigen Konjugat 2 wird die gebundene Enzymaktivität des Konju-
gates bestimmt (blaue Farbreaktion). Die enzymatische Umsetzung des Chromogens wird
durch Zusatz von Stopplösung POD unterbrochen (gelbe Farbreaktion). Die Farbintensität ist
der in der Probe vorhandenen HIV-p24 Antigen- und HIV-Antikörper-Konzentration proportional.
Reagenzien
Inhalt der Handelspackung
                                              2 x 96                  10 x 96
           ®
Enzygnost HIV Integral:                       2 Testplatten           10 Testplatten
HIV-Konjugat 1:                               2 x 1 Flasche           10 x 1 Flasche
HIV-Konjugat-Puffer 1:                        2 x 15 ml               10 x 15 ml
HIV-Konjugat 2:                               2 x 15 ml               10 x 15 ml
HIV-Probenpuffer:                             2 x 15 ml               4 x 15 ml
HIV-Kontrolle, positiv:                       2 x 1,4 ml              3 x 1,4 ml
HIV-Kontrolle, negativ:                       2 x 2,0 ml              3 x 2,0 ml
Etikett "Leerflasche für HIV-Konjugat 1"      -                       1 Stück
Etikett "Leerflasche für HIV-Konjugat 2"      -                       1 Stück
Packungsbeilage                               1 Stück                 1 Stück
Barcode-Wertetabelle                          1 Stück                 1 Stück
PE-Beutel                                     1 Stück                 1 Stück
Zusätzlich benötigte Materialien für die Packungen 2 x 96 und 10 x 96:
Zusatz-Reagenzien für Enzygnost® TMB (Bestell-Nr. OUVP)
Zusammensetzung
Enzygnost® HIV Integral Testplatte
Mit einem Gemisch aus rekombinanten Proteinen (E.Coli) und synthetischen Peptiden aus
HIV 1 gp41, HIV 1 (Subtyp O) gp41, HIV 2 gp36, sowie polyklonalen Antikörpern (Kaninchen)
gegen HIV p24 beschichtete Mikrotitrationsplatte.
HIV-Konjugat 1
Lyophilisat aus HIV 1-, HIV 2- und HIV 1(Subtyp O) -rekombinantem HIV-Protein (E.Coli)/ syn-
thetischen Peptiden und monoklonalen Antikörpern (Maus) gegen HIV p24, Biotin-konjugiert;
blau gefärbt. Rekonstitution mit 15 ml HIV-Konjugat-Puffer 1.
HIV-Konjugat-Puffer 1
Tris-Puffer mit Sapogenat* und Casein; gelb gefärbt.
Konservierungsmittel: Phenol (max. 1g/l)
HIV-Konjugat 2
Tris-Puffer mit Sapogenat* und Streptavidin, Peroxidase (POD)-konjugiert; rot gefärbt.
Konservierungsmittel: Phenol (max. 1g/l)
HIV-Probenpuffer
Phosphat-Puffer mit Casein und Triton X 100*; rot gefärbt.
Konservierungsmittel: Phenol (max. 1g/l)
HIV-Kontrolle, positiv
Hitzebehandeltes Humanserum mit Antikörpern gegen HIV 1-Antigene, stabilisiert.
Extinktionsrichtwert: ≥ 0,7
Konservierungsmittel: Phenol ( max. 1g/l)
HIV-Kontrolle, negativ
Humanserum ohne HIV-Antigen und ohne Antikörper gegen HIV 1-, HIV 2- und HIV1 (Subtyp
O)-Antigene, stabilisiert.
Extinktionsrichtwert: ≤ 0,15
Konservierungsmittel: Phenol (max. 1g/l)


OQTO G11 C0541 (1584) H   12
Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen
1. Nur zur in vitro diagnostischen Anwendung.
2. Jede individuelle Blutspende, die zur Herstellung von Kontroll-Sera vorgesehen ist, wurde
   auf HBsAg, Anti-HCV, Anti-HIV 1 und Anti-HIV 2 untersucht. Für die Herstellung des Kontroll-
   Serums, negativ, werden nur Sera mit negativem Befund verwendet. Das positive Kontroll-
   Serum wurde hitzebehandelt ( mindestens 1 Stunde bei + 56°C).
   Unabhängig davon sollten alle aus menschlichem Blut gewonnenen Proben (z. B. Patienten-
   sera) und Produkte (z.B. Kontrollsera) wegen nie völlig auszuschließender Gefährdung
   durch Krankheitserreger mit angemessener Sorgfalt unter Einhaltung der bei Biogefährdung
   empfohlenen Sicherheitsmaßnahmen gehandhabt werden (10).
3. Das Tragen von Untersuchungshandschuhen während der gesamten Testdurchführung wird
   angeraten.
4. Für die Entsorgung fester infektiöser Materialien empfiehlt sich eine Autoklavierung von min-
   destens 1 Stunde bei +121 °C. Alle abgesaugten Lösungen sind in zwei hintereinanderge-
   schalteten Vorlagen zu sammeln. Die Vorlagen sollten ein Desinfektionsmittel enthalten, das
   geeignet ist, human-pathogene Viren zu inaktivieren. Die vom Hersteller angegebenen Kon-
   zentrationen und Einwirkungszeiten müssen beachtet werden.
Vorbereitung der Reagenzien
Alle Reagenzien und Proben vor Testbeginn auf +15 bis +25 °C erwärmen. Dabei die Testplatte
nicht dem Behältnis entnehmen.
Für die Testdurchführung nicht benötigte Riegel dem Halterahmen entnehmen und für die späte-
re Verwendung lagern (siehe Tabelle 1).
Der Packung Enzygnost® HIV Integral 10 x 96 liegt je ein barcodiertes Etikett für das HIV-Konju-
gat 1 und das HIV-Konjugat 2 bei. Um bei großen Serienlängen einen häufigen Spritzenwechsel
am BEP® III zu vermeiden, kann es sinnvoll sein, mehrere Abfüllungen der Konjugate in eine
größere Flasche (z.B. noch unbenutzte überzählige Leerflaschen für Chromogen-Gebrauchslö-
sung, siehe Zusätzlich benötigte Materialien) umzuschütten, mit dem jeweiligen Etikett "Leer-
flasche für Konjugat..." zu etikettieren und ins Reagenzienrad einzustellen.
Je Testplatte 20 ml Waschlösung POD (Zusatzreagenzien-Kit) mit destilliertem oder entioni-
siertem Wasser auf 400 ml verdünnen.
Je Testplatte 1 ml Chromogen TMB mit 10 ml Puffer/Substrat TMB (Zusatzreagenzien-Kit ) in
der mitgelieferten Leerflasche verdünnen (Chromogen-Gebrauchslösung ) und verschlossen un-
ter Lichtschutz aufbewahren. Flasche nach Gebrauch sorgfältig mit destilliertem Wasser spülen.
Wegen technisch bedingter Überfüllung ist das Überführen des Flascheninhalts von Chromogen
TMB in die Abfüllung Puffer/Substrat TMB nicht zulässig.
HIV-Konjugat 1-Lösung: Den gesamten Inhalt einer Flasche HIV-Konjugat-Puffer 1 (15 ml, gelb
gefärbt ) in eine Flasche HIV-Konjugat 1 (Lyophilisat, blau gefärbt) überführen. Durch leichtes
Schwenken das Lyophilisat vollständig auflösen. Die HIV-Konjugat 1-Lösung ist dann grün gefärbt.
Vor Gebrauch sollte die HIV-Konjugat 1-Lösung mindestens 15 Minuten äquilibrieren.
Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen
Ungeöffnet sind alle Bestandteile der Kombinationspackung Enzygnost® HIV Integral bei einer
Lagertemperatur von +2 bis +8 °C bis zu den auf den Etiketten angegebenen Daten verwendbar.
Die Haltbarkeit und Lagerbedingungen der geöffneten Reagenzien sind der Tabelle 1 im Anhang
zu entnehmen.

Erforderliche Geräte:
BEP® II:                Zur automatischen Durchführung der Reagenzien-Dosierung und der
                        Waschschritte
BEP® III:               Zur automatischen Testabarbeitung nach der Probendosierung sowie
                        Auswertung
BEP® 2000:              Zur vollautomatischen Testabarbeitung sowie Auswertung
Pipetten:               Kolbenhubpipetten 25, 100 und 1000 µl
Inkubator:              Bedecktes Wasserbad (+37 ± 1 °C) oder vergleichbare Inkubationsme-
                        thoden
Alle zur Testdurchführung eingesetzten Geräte müssen validiert sein.

OQTO G11 C0541 (1584) H   13
Untersuchungsmaterial
Zur Untersuchung können Einzelproben (Human-Seren oder EDTA/Heparin/Citrat-Plasmen)
verwendet werden, welche nach Standard-Labortechniken entnommen wurden. Die Proben
sollten maximal 3 Tage bei +2 bis +8 °C gelagert werden. Zur längeren Lagerung sind die Pro-
ben einzufrieren.
Methodik
Testdurchführung mit BEP® II
 1. Ansatzschema: Benötigte Anzahl der Auftragstellen feststellen ( = Anzahl der zu untersu-
    chenden Proben plus 5 Vertiefungen für Kontrollen).
 2. Probenpufferdosierung: 25 µl Proben-Puffer je Vertiefung vorlegen.
 3. Probendosierung: In 3 Vertiefungen je 100 µl HIV-Kontrolle, negativ (A1 bis C1), in 1 Ver-
    tiefung 100 µl HIV-Kontrolle, positiv ( D1 ), in die folgenden Vertiefungen je 100 µl unver-
    dünnte Probe dosieren und am Ende der Serie bzw. Testplatte noch einmal 100 µl HIV-
    Kontrolle, positiv einpipettieren.
    Alternativ zu oben aufgeführtem Pipettierschema ist es auch erlaubt, die HIV-Kontrolle, po-
    sitiv in Doppelbestimmung am Anfang der Testreihe aufzutragen.
    Pipettierschema: In 3 Vertiefungen je 100 µl HIV-Kontrolle, negativ ( A1 bis C1 ) , in 2 Vertiefun-
    gen je 100 µl HIV-Kontrolle, positiv ( D1 und E1 ) und in die folgenden Vertiefungen je 100 µl
    unverdünnte Probe dosieren.
    Die Pipettiervorgänge sollten innerhalb von 30 min pro Testplatte durchgeführt werden.
 4. Probeninkubation: Die Testplatte mit Folie abkleben und 30 ± 2 min bei 37 ±1°C inkubie-
    ren, Waschvorgang unmittelbar anschließen.
 5. Waschen: Folie abziehen, alle Vertiefungen aussaugen und mit je ca. 0,3 ml Waschlösung
    4 mal waschen.
 6. Dosierung von HIV-Konjugat 1-Lösung: In jede Vertiefung 100 µl HIV Konjugat 1-Lösung
    einfüllen, mit neuer Folie abkleben und sofort in den Inkubator stellen.
 7. HIV-Konjugat 1 - Inkubation: 30 ± 2 min bei 37 ± 1°C, wie unter 4. beschrieben, inkubieren,
    Waschvorgang unmittelbar anschließen.
 8. Waschen: Folie entfernen und wie unter 5. beschrieben, 4mal waschen.
 9. Dosierung von HIV-Konjugat 2: In jede Vertiefung 100 µl des HIV-Konjugates 2 einfüllen,
    mit neuer Folie abkleben und sofort in den Inkubator stellen.
10. HIV-Konjugat 2-Inkubation: 30 ± 2 min bei 37 ± 1°C, wie unter 4. beschrieben, inkubieren,
    Waschvorgang unmittelbar anschließen.
11. Waschen: Folie entfernen und wie unter 5. beschrieben, 4 mal waschen.
12. Substratdosierung: In jede Vertiefung 75 µl der Chromogen-Gebrauchslösung einfüllen.
13. Substratinkubation: Mit neuer Folie abkleben und 30 ± 2 min bei +15 bis +25°C lichtge-
    schützt inkubieren.
14. Stoppreaktion: Folie entfernen. Je Vertiefung 75 µl Stopplösung POD zugeben, dabei den
    gleichen Zeittakt wie bei Punkt 12. einhalten.
15. Messung: Innerhalb einer Stunde bei 450 nm photometrieren. Als Wellenlänge der Refe-
    renzmessung wird 650 nm (ggfs. zwischen 615 nm und 690 nm) empfohlen.
Testdurchführung mit BEP® III
Bei der Abarbeitung mit BEP® III müssen die Testplatten einschließlich der Probendosierung
(Punkt 1 und 2 der "Testdurchführung mit BEP® II") vorbereitet werden. Unmittelbar im An-
schluss daran werden die Testplatten offen, d.h. nicht mit Folie abgeklebt, in den BEP® III einge-
geben. Dabei ist zu beachten, dass teilbestückte Testplatten mit "Wasserriegeln" auf mindestens
halbe Testplatten (6 Testriegel) zu ergänzen sind. Die anschließende Testabarbeitung erfolgt
vollautomatisch (siehe BEP® III-Bedienungsanleitung).
Die in der BEP® III Software eingestellten Inkubationszeiten können auf Grund der technischen
Rahmenbedingungen (Gerätetaktung) von denen der BEP® II Prozessierung abweichen, sind
jedoch in der Kombination BEP® III/Enzygnost® validiert worden.
Testdurchführung mit BEP® 2000
Die Probendosierung und anschließende Testabarbeitung erfolgt vollautomatisch im Gerät (sie-
he BEP® 2000-Bedienungsanleitung).
OQTO G11 C0541 (1584) H   14
Testvalidierung
Die Einzelmeßwerte der Extinktionen für die Kontroll-Sera werden zur Berechnung der Mittel-
werte eingesetzt, wenn:

-0,010 ≤ Eneg. ≤ 0,150
         Epos. ≥ 0,700

Von den drei Extinktionswerten der negativen Kontrolle kann ein außerhalb der Spezifikation
liegender Wert vernachlässigt werden.
Die Extinktionswerte der positiven Kontrolle müssen beide die Spezifikation erfüllen.
Werden diese Spezifikationen nicht erfüllt, ist der Test zu wiederholen.
Testauswertung
Die Auswertungen erfolgen mit BEP® 2000 und BEP® III automatisch. Bitte dazu die Bedie-
nungsanleitungen heranziehen. Die nachfolgenden Kapitel sind bei Auswertung ohne Software-
unterstützung zu beachten.
Aus den Extinktionswerten der negativen Kontrolle wird der Mittelwert gebildet.
Zur Grenzwertberechnung wird zum Extinktionsmittelwert der negativen Kontrolle ein Wert von
0,450 addiert.
                      –
Grenzwert (cut off) = E neg. + 0,450

Als grenzwertiger Bereich wird definiert:
Grenzwert bis Grenzwert - 0,05

Nach den Kriterien des Tests werden die Untersuchungsproben wie folgt klassifiziert:
Testergebnis:
1.       EProbe < cut off - 0,05 = "negativ"
2.       EProbe > cut off        = "reaktiv"
3.       cut off - 0,05 ≤ EProbe ≤ cut off = "grenzwertig"

Proben, die Extinktionswerte im grenzwertigen Bereich oder höhere Extinktionen ergeben, sind
in Doppelbestimmung erneut zu testen. Ergeben sich für initial reaktive Proben bei beiden Ein-
zelwerten der Wiederholungstestung Extinktionswerte unterhalb des grenzwertigen Bereiches,
ist die Probe nach den Kriterien des Tests als negativ anzusehen.
Bei erneut grenzwertigem oder höherem Extinktionswert bei mindestens einem der beiden Ein-
zelwerte gilt die Probe als wiederholt reaktiv. Alle wiederholt reaktiv reagierenden Proben sollten
unbedingt einer Bestätigung mit Hilfe sogenannter Konfirmationstests (z.B. Immunoblot, Nu-
cleinsäure-Analyse) zugeführt werden. Sicherheitshalber sollte eine Folgeabnahme (ungefähr 2
Wochen später) erneut analysiert werden.
Einschränkungen und Fehlerquellen
 1. Antikoagulantien wie Heparin, EDTA und Citrat beeinflussen das Testergebnis nicht.
 2. Hämolytische oder ikterische Proben führen zu keiner Testbeeinträchtigung.
 3. Proben mit den potentiell störenden Substanzen ANA, Antikörpern gegen E.-Coli und EBV,
    sowie Seren von Schwangeren wurden mit dem Test überprüft. Mit den eingesetzten Proben
    wurde keine Beeinflussung des Testergebnisses beobachtet.
 4. Bei hitzebehandelten Proben ( 30 min, 56°C ) wurde keine Störung beobachtet.
 5. Ungenügend geronnene Seren und mikrobiell kontaminierte Untersuchungsproben sollten
    nicht eingesetzt werden. Eventuell vorhandene partikuläre Komponenten (z.B. Fibrin-Ge-
    rinnsel, Erythrozyten) sollten vor der Testdurchführung entfernt werden.
 6. Lipämische, rheumafaktorhaltige, AMA-haltige, sowie Proben mit Antikörpern gegen HAV
    können zu erhöhter Reaktivität führen.
 7. Enzygnost® HIV Integral ist ein Test zum gleichzeitigen Nachweis von HIV p24-Antigen und HIV-
    Antikörpern und darf nicht zur alleinigen Detektion von HIV p24-Antigen eingesetzt werden.

OQTO G11 C0541 (1584) H   15
8. Bei aufgetauten Proben ist auf eine gute Homogenisierung des Materials zu achten.
 9. Die Reagenzien (ausgenommen Waschlösung POD, Stopplösung POD und die aus den
    chargengebundenen Reagenzien Chromogen TMB und Puffer/Substrat TMB hergestellte
    Chromogen-Gebrauchslösung) sind nur chargengebunden zu verwenden, d. h. nur in der
    Kombination der einzelnen 6-ziffrigen Chargen-Bezeichnung (Ch.-B.), die auf der Packung
    aufgedruckt, bzw. der separat beigepackten Barcode-Wertetabelle zu entnehmen sind.
10. Puffer/Substrat TMB, Chromogen-Gebrauchslösung und Stopplösung POD dürfen nicht in
    Kontakt mit Schwermetallionen oder oxidierenden Substanzen kommen (keine Pipetten mit
    flüssigkeitsführenden Metallteilen verwenden). Die Substratreaktionen nicht in der Nähe
    von Hypochlorit-haltigen Desinfektionsmitteln durchführen. Eine spontane Blaufärbung der
    Chromogen-Gebrauchslösung vor der Übertragung in die Testplatte deutet auf Kontaminati-
    on hin; eine frische Lösung ist in einem sauberen Gefäß anzusetzen. Hautkontakt mit den
    vorgenannten Lösungen ist zu vermeiden.
11. Die Testplatte soll während der Inkubation ruhig liegen ( z. B. auf fixierter Schwimmhilfe oder
    im nicht zirkulierenden Wasserbad); die Kavitäten sind dabei in Kontakt mit dem temperier-
    ten Wasser. Werden Stabilisatoren zur Verhinderung der Verkeimung des Wassers verwen-
    det, so ist sorgfältig darauf zu achten, daß weder die Testplattenoberfläche noch die Näpf-
    chen mit diesen Lösungen in Kontakt kommen, da dadurch unspezifische Reaktionen her-
    vorgerufen werden können.
12. Bei stark reaktiven Proben kann bei der Stoppreaktion der Farbstoff ausfallen.
    Die photometrische Auswertung wird dadurch nicht beeinflußt.
13. Die Kontrollsera sind unter Verwendung nativer Humansera hergestellt. Daher können Trü-
    bungen auftreten, die das Testergebnis jedoch nicht beeinflussen.
14. Die Testplatte vor Testbeginn nicht längere Zeit dem direkten Sonnenlicht aussetzen.
Leistungsmerkmale des Tests
Sensitivität und Spezifität
Die Ergebnisse zur Prüfung der Sensitivität und Spezifität sind in den Tabellen 2 + 3 ( im Anhang)
zusammengefasst. Bei der Ermittlung der Sensitivität wurden insgesamt 515 Anti-HIV 1, 164
Anti-HIV 2, 26 Anti-HIV 1 ( Subtyp O ) und 64 HIV-Antigen positive Proben untersucht. Alle
getesteten HIV-Antigen/-Antikörper positiven Proben wurden nach den Kriterien des Enzygnost®
HIV Integral positiv gefunden. Die Reaktivität des Tests bei Serokonversionsproben wurde an-
hand von 34 Serokonversionspanel untersucht. Dabei zeigt sich, dass Enzygnost® HIV Integral
eine verbesserte Sensitivität bzgl. der Erkennung von Serokonversionen gegenüber reinen HIV-
Antikörper-Testen aufweist. Unabhängig davon kann nicht ausgeschlossen werden, dass sich
bei breiter Anwendung des Tests einzelne Proben dem Nachweis entziehen können.
Bei der Testung des SFTS Panel (1996) wurde die mit 250 pg HIV-Antigen/ml deklarierte Probe
(Nr. 2024) reproduzierbar positiv gefunden. Durch Testung der mit 100 pg und der mit 250 pg
HIV Antigen/ml deklarierten Verdünnungsstufen des SFTS-Panels wurde eine analytische Sen-
sitivität zwischen 100 und 250 pg HIV Antigen/ml ermittelt.
Bei der Ermittlung der Spezifität wurden insgesamt 8851 HIV-negative Blutproben untersucht und eine
Spezifität von 99,3 bis 99,95 % ( initiale Testung ) bzw. 99,7 bis 100 % (Retestung) ermittelt. Bedingt
durch das Untersuchungskollektiv, die Testdurchführung u.a. sind abweichende Werte möglich.
Nach derzeitigem Kenntnisstand kann aus einem positiven Ergebnis der HIV-Testung nicht mit
Sicherheit abgeleitet werden, dass infektiöses HIV 1 oder HIV 2 im Blut vorhanden ist, wie auch ein
negatives Testergebnis keineswegs die Anwesenheit von HIV 1 oder HIV 2 sicher ausschließt.
Reproduzierbarkeit
Die Ergebnisse zur Intra/Inter-assay-Reproduzierbarkeit sind der Tabelle 4 ( im Anhang ) zusam-
mengefasst. Es handelt sich hierbei um beispielhaft ermittelte Daten. Abhängig von der Test-
durchführung u. a. sind durchaus abweichende Werte möglich.
Enzygnost und BEP sind eingetragene Marken der Dade Behring Marburg GmbH in den USA,
Deutschland und anderen Ländern.
* Sapogenat ist eine Marke von Clariant. Triton X 100 ist eine Marke von Merck.




                                                                            0197
        Dade Behring Marburg GmbH
        Emil-von-Behring-Str. 76
        D-35041 Marburg
        www.dadebehring.com
OQTO G11 C0541 (1584) H   16
Tab. 1 Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen

    Material/Reagenz                     Zustand          Lagerung          Stabilität*

    Enzygnost® HIV Integral Testplatte   nach Öffnen      +2 bis +8 °C      4 Wochen
                                                          im Beutel mit
                                                          Trockenpatronen

    HIV-Konjugat 1                       nach             +2 bis +8 °C      4 Wochen
                                         Rekonstitution   +15 bis +25 °C    2 Tage

    HIV-Konjugat 2                       nach Öffnen      +2 bis +8 °C      4 Wochen
                                                          +15 bis +25 °C    2 Tage

    HIV-Probenpuffer                     nach Öffnen      +2 bis +8 °C      4 Wochen

    HIV-Kontrolle, positiv               nach Öffnen      +2 bis +8 °C      4 Wochen
                                                          -20 °C            3 Monate

    HIV-Kontrolle, negativ               nach Öffnen      +2 bis +8 °C      4 Wochen
                                                          -20 °C            3 Monate

    Chromogen TMB                        nach Öffnen      +2 bis +8 °C      Verfalldatum

    Puffer/Substrat TMB                  nach Öffnen      +2 bis +8 °C      Verfalldatum

    Chromogen-Gebrauchslösung            verdünnt         +2 bis +8 °C      5 Tage
                                         1 + 10           +15 bis +25 °C    8 Stunden
                                                          geschl. Gefäß,
                                                          lichtgeschützt

    Waschlösung POD                      nach Öffnen      +2 bis +8 °C      Verfalldatum
    (Konzentrat)                         verdünnt 1:20    +2 bis +8 °C      1 Woche
                                         verdünnt 1:20    +18 bis +25 °C    1 Tag

    Stopplösung POD                      nach Öffnen      +2 bis +8 °C      Verfalldatum

*    in keinem Fall länger als bis zum Verfalldatum




OQTO G11 C0541 (1584) H      17
Tab. 2 Sensitivität
Bei den Untersuchungen von Sensitivität wurden folgende Daten ermittelt:

      Probenkollektiv                 Probenanzahl                       Initial reaktiv
 Anti-HIV 1 pos.                           515                                515
 Anti-HIV 2 pos.                           164                                164
 Anti-HIV 1 (Subtyp O) pos.                 26                                 26
 HIV-Antigen pos.                           64                                64*

 Serokonversionspanel                 34 HIV Panels               Sensitivität gegenüber HIV-
                                                                  Antikörper Testen verbessert
* Bei frühen Serokonversionsproben haben HIV-p24-Antigen-Teste für die HIV-Antigen-Detek-
  tion eine bessere Nachweisempfindlichkeit.

Tab. 3 Spezifität
Bei der Untersuchung zur Spezifität wurden folgende Daten ermittelt:

  Probenkollektiv          Probenanzahl               Initial reaktiv         Retest reaktiv
  Negative Seren (A)           4002                        9                           8
  Negative Seren (B)           2135                        1                           0
  Negative Seren (C)           2370                        17                          7
  Negative Plasmen (D)         344                         1                           1

Tab. 4 Reproduzierbarkeit
Bei der Untersuchung zur Intra-assay-Reproduzierbarkeit wurden die Proben an 5 Tagen in je-
weils 8fach-Bestimmung getestet. Die Berechnung des Variationskoeffizienten (VK) erfolgt nach
dem Varianzkomponentenmodell.

                                                      Enzygnost® HIV Integral
     Probe                       Extinktionsmittelwert                         % VK
     P1                                   0,817                                  4,4
     P2                                   1,781                                  5,7
     P3                                   1,202                                  4,4
     P4                                   0,519                                  3,8

Bei den Untersuchungen zur Inter-assay-Reproduzierbarkeit wurden die Proben an 5 Tagen in
jeweils 8fach-Bestimmung getestet. Die Berechnung des Varationskoeffizienten (VK) erfolgte
nach dem Varianzkomponentenmodell.

                                                      Enzygnost® HIV Integral
     Probe                       Extinktionsmittelwert                         % VK
     P1                                   0,817                                  12
     P2                                   1,781                                  5,9
     P3                                   1,202                                  2,3
     P4                                   0,519                                  4,1




OQTO G11 C0541 (1584) H   18
Tab. 5 Testdurchführung und -programmierung
                                     Enzygnost® HIV Integral
                  Testdurchführung                                     Menüprogrammierung
              (BEP® II, BEP® III, BEP® 2000)                           für den
                                                           BEP® 2000
                     Vorbereitung der Reagenzien                       BEP® II
                                                                       MENU NO
                         25 µl HIV-Probenpuffer
                                                                       OPERATE 1           YES
                                                                       Dosierung Probenpuffer
                   3 x 100 µl HIV-Kontrolle, negativ                   WASHINGS             0
                   1 x 100 µl HIV-Kontrolle, positiv                   ASPIRATE            NO
                     je 100 µl unverdünnte Probe                       SOAKTIME             0
                   1 x 100 µl HIV-Kontrolle, positiv
                                                                       DISP VOL             25
                                                                       CHANNEL NO           3
            BEP® II                                BEP® III            PHOT                NO
                                                                       OPERATE 2           YES
         30 min ± 2 min                   teilbestückte Platten mit    Waschen und Dosierung Konjugat 1
           (37 ± 1 °C)                   „Wasserriegeln“ auf halbe     WASHINGS             4
                                                                       ASPIRATE            NO
                                              Platten ergänzen
                                                                       SOAKTIME             0
         4 x Waschen:                                                  DISP VOL            100
            BEP® II                                                    CHANNEL NO           1
                                                                       PHOT                NO
 100 µl HIV-Konjugat 1-Lösung                                          OPERATE 3           YES
                                                                       Waschen und Dosierung Konjugat 2
         30 min ± 2 min                                                WASHINGS             4
           (37 ± 1 °C)                                                 ASPIRATE            NO
                                               automatische            SOAKTIME             0
                                              Testabarbeitung          DISP VOL            100
         4 x Waschen:
                                                                       CHANNEL NO           2
            BEP® II                                                    PHOT                NO
                                                                       OPERATE 4           YES
     100 µl HIV-Konjugat 2                                             Waschen und Dosierung Chromogen
                                                                       WASHINGS             4
                                                                       ASPIRATE            NO
         30 min ± 2 min                                                SOAKTIME             0
           (37 ± 1 °C)                                                 DISP VOL             75
                                                                       CHANNEL NO           4
          4 x Waschen:                                                 PHOT                NO
             BEP® II                                                   OPERATE 5           YES
                                                                       Dosierung Stopplösung
                                                                       WASHINGS             0
       75 µl Chromogen-                                                ASPIRATE            NO
        gebrauchslösung                                                SOAKTIME             0
                                                                       DISP VOL             75
                                                                       CHANNEL NO           5
         30 min ± 2 min                                                PHOT                YES
 (+15 bis +25 °C, lichtgeschützt)                                      MEAS WL             450
                                                                       REF WL              650
                                                                       BLK COR             NO
       75 µl Stopplösung                                               EVAL MODE            1
                                                                       GEN CUT             NO
                                                                       NEG CONT             3
       nach maximal 1 h                                                MAX NEG            0.150
                                                                       MIN NEG               -
      Auswertung 450 nm                                                FACT NEG              -
   (Referenzwellenlänge: 650 nm)                                       MAX POS               -
                                                                       THRESH             0.450
          Testergebnis                            Testergebnis         CUT OFF               -


OQTO G11 C0541 (1584) H      19
Enzygnost® HIV Integral
Domaine d’utilisation et indication
Test immunoenzymatique pour la mise en évidence qualitative d’une infection à VIH, basée sur la
détection de l’antigène VIH p24, des anticorps anti-virus de l’immunodéficience humaine des classes
1 et 2 (VIH 1 et VIH 2), ainsi que des anticorps anti-VIH 1 sous-type O, dans le sérum ou le plasma.
La réalisation du test immunoenzymatique se fait à l’aide des ELISA Processeurs BEP® II, BEP® III et
BEP® 2000. Le test a été mis au point pour l’analyse d’échantillons individuels, et non pas
d’échantillons poolés ou dilués. Le produit ne doit être utilisé qu'à des fins de diagnostic in vitro.
Intérêt diagnostique
Le Syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA) a été reconnu pour la première fois en 1981
comme tableau clinique autonome. Deux virus différents d’immunodéficience humaine (VIH 1 et
VIH 2) sont aujourd’hui considérés comme responsables de la maladie. L’isolement du VIH 1
(synonymes : LAV/HTLV III) a réussi dès 1983 (1, 2). En 1986, un deuxième virus (VIH 2),
également pathogène pour l’Homme, a été isolé (3).
Le dosage sérologique des anticorps anti-VIH présente un intérêt particulier pour la médecine
transfusionnelle, puisqu’il permet de prévenir la propagation de la maladie. Depuis 1985, la
recherche d’anticorps anti-VIH 1 sur les dons de sang est obligatoire aussi bien pour les centres
de transfusion sanguine que pour les fabricants de produits sanguins. Des informations complé-
mentaires sur le développement d’infections à VIH 2 ont depuis généralisé le dépistage en rou-
tine des anticorps anti-VIH 1 et VIH 2, dans le souci d’exclure le transfert possible de la maladie
par la transfusion ou l’utilisation de préparations sanguines.
En 1990, un nouveau VIH a été décrit, auquel il n’a tout d’abord été attribué qu’un faible intérêt
sérologique (4). Ce n’est qu’en 1994 que deux équipes indépendantes ont réussi simultanément à
définir la séquence de ce nouveau sous-type (5, 6). Parallèlement aux travaux virologiques, plu-
sieurs équipes de recherche ont pu montrer l’intérêt sérologique du virus, aujourd’hui appelé VIH 1-
sous-type O (7, 8). Un grand nombre de tests anti-VIH 1+2 ont alors montré qu’ils révélaient difficile-
ment les anticorps anti-sous-type O (9). Le besoin est donc apparu de disposer d’un test fiable pour
la recherche simultanée de ce nouveau variant VIH et des isolats VIH 1 et VIH 2 déjà établis.
Dans quelques cas de séroconversions à VIH, l’antigène VIH p24 a été révélé avant l’apparition
des anticorps anti-VIH. Afin de fermer au maximum la fenêtre diagnostique entre l’infection à
VIH et la première manifestation sérologique, il était donc intéressant d’élargir le test d’anticorps
à une reconnaissance de l’antigène VIH p24.
Bien que la mise en évidence d’anticorps anti-VIH spécifiques et/ou de l’antigène ne permette pas
de dire avec certitude si le sang contient du VIH 1 ou du VIH 2 infectieux au moment du prélève-
ment, de même qu’un résultat négatif ne permet pas d’exclure avec certitude la présence de VIH 1
ou de VIH 2, le test combiné antigène/anticorps constitue pourtant actuellement la meilleure solu-
tion pour dépister et éliminer avec une grande probabilité les donneurs infectés par le VIH.
Principe de la méthode
Enzygnost® HIV Integral est un test immunoenzymatique, basé sur la recherche simultanée
d’antigènes VIH et d’anticorps anti-VIH.
Les immunoglobulines HIV-spécifiques contenues dans l’échantillon à tester réagissent dans un
premier temps avec les protéines recombinantes et peptides synthétiques VIH 1, VIH 2 et/ou
VIH 1 (sous-type O) fixés à la surface de la plaque de microtitration.
Si l’échantillon contient de l’antigène VIH p24, celui-ci se fixe simultanément aux anticorps anti-
VIH p24 polyclonaux fixés à la surface de la plaque de microtitration.
Après élimination par lavage des éléments non liés de l’échantillon, et dans une deuxième
étape, les anticorps spécifiques liés sont marqués par les protéines recombinantes et peptides
synthétiques VIH 1, VIH 2 et/ou VIH 1 (sous-type O) marqués à la biotine (technique sandwich
antigène). Simultanément, l’antigène VIH lié est marqué aux anticorps anti-VIH p24 mono-
clonaux conjugués à la biotine (technique sandwich anticorps).
Après élimination des conjugués à la biotine en excès, et dans une troisième étape, le conjugué
2 (streptavidine/POD) réagit avec les conjugués à la biotine spécifiques, liés à la phase solide.
Après élimination du conjugué 2 en excès, l’activité enzymatique du conjugué fixé est mesurée
(réaction colorée bleue). La transformation enzymatique du chromogène est stoppée par
l’addition de Solution d’arrêt POD (réaction colorée jaune). L’intensité de la coloration est pro-
portionnelle à la concentration d’antigène VIH p24 et d’anticorps VIH présents dans l’échantillon.
OQTO G11 C0541 (1584) H   20                                                     Edition Octobre 2003
You can also read
Next part ... Cancel