Specifications and Standards for Food, Food Additives, Etc.

Provisional Translation
from the Japanese Original


Specifications and Standards for Food, Food Additives, Etc.
M i n i s t r y o f H e a l t h a n d We l f a re N o t i f i c a t i o n N o . 3 7 0 , 1 9 5 9

T h e Mi n i s te r o f H e a lt h an d Wel f a r e h a s e s t a b l i sh e d t h e s p e cif i c a t i o n s an d
s t a n d a r d s f o r f o o d , f o o d ad d i t i v es g i ve n b e lo w, b a s ed o n A r t i c l e 1 0 an d A r t i c l e
11 P a r a g r ap h 1 o f t h e F o o d S a n ita t i o n L a w ( L a w N o . 2 3 3 , 1 9 4 7 ) .




Part I       Food
  Section A          G e n e r a l C o m p o s i t i o n a l St a n d a r d s f o r Fo o d
      1 . F o o d s s h a l l n o t c o n ta i n any a n t i b i ot ic s o r c h e mi c a l l y s y n t h e s iz e d
        a n t ib a c te r i a l s u b s ta n c e s ( s u b s t an c e s o b t ain e d b y i n st i g a ti n g c h e mi c a l
        r e a c t i o n s to e l e me n t s a n d /o r co mp o u n d s t h r o u g h c h e mi c a l me t h o d s ,
        e x c e p t f o r d e co mp o s i t i o n ; t h i s a p p li e s h e r e i n a f t e r i n t h i s p a r a g r a p h ) ,
        e x c e p t f o r th e f o l lo w i n g c a s e s :

        ( 1 ) W h e n t h e s u b s tan c e c o n c e rn e d i s id en t i c al t o th e f o o d ad d i ti v e
            d e t e r mi n e d b y th e M i n i s t e r o f H e al t h , L a bo u r a nd We l f a re a s h a vi n g n o
            p o t en t i al t o c a u s e d a ma g e t o h u ma n h e a lt h u n d e r A r t i c le 1 0 o f t h e F o o d
            S a n i t a ti o n L a w ( L a w N o . 2 3 3 , 1 9 4 7 , h e r e in a f t e r “t h e L a w. ” )

        ( 2 ) W h e n co mp o s i t i o n a l s t an d a r d s a r e s e t f o r t h in 5 , 6 , 7 , 8 o r 9 b el o w f o r
            the substance concerned.

        ( 3 ) W h e n th e f o o d p r o d u c t c o n c e rn e d h a s b e en ma n u f a c t u r e d o r p r o c e s s e d
            u s i n g a f o o d in g r e d ie n t t h a t me e t s t h e c o mp o s i t i o n a l s tan d a r d s g i v en in
            5 , 6 , 7 , 8 o r 9 b e l o w ( e x c e p t f o r f o o d s c o n ta i n in g a n t ib i o t i cs o r
            c h e mi c a l l y       s y n t h e s iz e d     an t ib a c t e r i a l   s u b s t a n ce s      for        which
            c o mp o s i t i o n a l s t an d a rd s a r e n o t se t f o r t h in 5 , 6 , 7 , 8 o r 9 b e lo w. )


      2.~4.       ( O mi t t e d )


      5 . F o o d s sh a l l n o t co n t a in s ub s ta n c e s ( in c lu d i ng su b s ta n c e s p r o du c e d b y
        c h e mi c a l t r a n s f o r ma t i o n : t h i s a p p l i e s h e r e in a f t e r i n t h i s p a r a g r a p h ) u s ed
        a s i n g r e d i en t s o f a g r ic u l tu r a l c h e mi c a l s a n d o t h e r c h e mi c a l s u b s t a n c e s
        l i s t e d i n th e t ab l e i n ( 1 ) b e l o w. T h e ag r ic u l tu r a l c h e mi c a l s a n d o th e r
        c h e mi c a l s u b s t a n c e s st a t e d a b o v e, h e r e a n d a l s o la t e r in th i s p a r ag r a p h ,
        r e f e r t o s u b s t a n ce s u s e d f o r p u r p o s e s d e s ig n a te d b y t h e A g r i c u l t u r e ,
        F o r e s t r y a n d F i s h e r i e s M i ni s t e r i al O r d i n an ce a c co r d i n g to th e p r o v i s io n



                                                               1/100
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      o f P a r a g r a p h 3 o f A r t i c l e 2 o f t h e L a w C o n ce r n i n g S a f e t y A s s u r a n c e a n d
      Q u a l i t y I mp r o v e me n t o f A g r i c u l t u r a l C h e mi c a l s an d F ee d s ( L a w N o . 3 5 ,
      1 9 5 3 ) , w h i c h i s s t i p u l a t ed u n d e r P a r a g r a p h 1 o f A r t i c l e 1 - 2 o f t h e
      A g r i c u l t u r al C h e mi c a l s R e g u l at i o n L a w ( L a w N o . 8 2 , 1 9 4 8 ) , w i t h s u ch
      a i ms a s a d d i n g to , mi x i n g w i th , o r in f i l t ra t i n g in t o f e e d s ( t h e f e e d s
      s t i p u la t ed u n d e r P a r ag r a p h 2 o f A r t i c l e 2 o f L a w N o . 3 5 ) , o r me d i c a l
      p r o d u ct s to b e u s ed f o r a n i ma l s , w h i c h a r e s t i p u la t ed in P a r a g r a p h 1 o f
      A r t i c l e 2 o f t h e P h a r ma c e u t i c a l A ff a i r s L a w ( L a w N o . 1 4 5 , 1 9 6 0 ) . I n
      a s s o c i a t io n w i t h t h i s r e g u l at i o n , a s a mp l e o f t h e f o o d s l i s te d i n t he
      “f o o d s ” c o lu mn i n t h e t a b l e in ( 2 ) b e l o w s h a l l be t e s te d u s i ng t he p a rt
      l i s t e d i n th e “s a mp l e s ” c o l u mn i n t h e t ab l e b y th e t e s t i n g me t h o d s
      d e s c r i b ed in ( 3 ) t o ( 1 6 ) b e l o w. N o i n g r e d ie n t s o f a g ri c u l tu r a l ch e mi c a l s
      o r o t h e r che mi c a l s u b st a n c e s s ha ll b e d e t ec t ed i n t h e s e te s t s .

      ( 1 ) S u b s t a n c e s u s e d a s i n g r e d i en t s o f a g r ic u l tu r a l c h e mi c a l s a n d o t h er
          c h e mi c a l s u b s t a n c e s th a t a r e s ti p u l a t ed to be “N o t d e t ec t e d ” i n f oo d s


          1. 2, 4, 5-T
          2 . A z o c yc lo t i n a nd c yh e x at i n
          3 . A mi t r o l
          4. Captafol
          5 . C a r b ad ox
          6 . C ou ma p h o s
          7 . C hl o r a mp h e ni c ol
          8. Chlorpromazine
          9 . D i e t h y l st i l b e st r o l
        1 0 . D i me t r i d a z o l e
        11 . D a mi n o z i d e
        1 2 . N i t r o f ur a n s
        1 3 . P r o p h am
        1 4 . Ma l a ch i t e g r e en
        1 5 . Me t r o n i d a zo l e
        1 6 . Ro n id az o l e




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      ( 2 ) S a mp l e s

                                  Food                                                 S a mp l e ma t e r i a l

        Barley and buckwheat                                            T h r e s h e d se e d s

        W h e a t an d r y e                                            H u s k e d s e ed s

        R i c e ( b r o wn r i c e )                                    H u s k e d s e ed s

        C o r n ( ma i z e )                                            S e e d s w i t h t h e h u s k s , th e s i lk a n d
                                                                        t h e co r e s r e mo v e d
        O t h e r c e r e al g r a i n s                                T h r e s h e d se e d s

        Peas, beans (dry)(including butter                              S e e d s w i t h o u t th e p o d s
        b e a n s , c o wb e a n s ( r e d b e a n s ) , l e n ti l ,
        l i ma b e a n s , p e g ia , s u lta n i , s u l t ap y a
        a n d w h it e b e a n s ) * , b r o a d b ea n s and
        soybeans (dry))
        Peanuts                                                         Wi t h t h e s h e l l s r e mo v e d

        O t h e r l e g ume s / p u l s e s                             S e e d s w i t ho u t th e p o ds

        A p r i c o t , mu me p l u m, c h e r r y,                     Wi t h t h e p ed u n cl e an d t h e s e ed s
        J a p a n e s e p lu m ( i n c l u d in g p r u n e )           r e mo v e d
        a n d n e c ta r i n e
        Peach                                                           Wi t h t h e s k i n s a n d t h e s e e d s
                                                                        r e mo v e d
        O r a n g e ( i n c l u d i n g n av e l o r a n g e ) ,        Whole fruit
        g r a p e f r u i t , c i t r u s n a t su d a id a i
        ( w h o l e ) , l ime a n d l e mo n
        C i t r u s n a t su d a id a i ( p u l p ) a n d u n sh u      Wi t h t h e p ee l s r e mo v e d
        o r a n g e ( p u lp )
        C i t r u s n a t su d a id a i , p ee l s                      Wi t h t h e c al y x e s r e mo v e d

        Other citrus fruits                                             Whole fruit

        P e a r, J a p a n e s e p e a r, q u i n ce a n d              Wi t h t h e b l o s s o m s c a r s , t h e c o r e s
        a p p le                                                        a n d th e p e d u n c le s r e mo v e d
        L o q u at                                                      Wi t h t h e p ed u n cl e s , th e s k i n s an d
                                                                        t h e s e ed s r e mo v e d
        Av o c a do a nd ma n g o                                       Wi t h t h e s ee d s r e mo v e d

        Kiwifruit                                                       Wi t h t h e s k i n s r e mo v e d

        Guava                                                           Wi t h t h e c al y x e s r e mo v e d

        Date                                                            Wi t h t h e c al y x e s a n d th e s e e d s
                                                                        r e mo v e d


                                                              3/100
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        Pineapple                                                       Wi t h t h e to p s r e mo v e d

        P a s s i o n f r u i t a n d p ap ay a                         Whole fruit

        B a n a na                                                      Wi t h t h e p ed i c e l s r e mo v e d

        St r a w b e r r y, c r a n b e r r y, h u c k l e b e r r y,   Wi t h t h e c al y x e s r e mo v e d
        b l a ck b e r r y a n d b l u eb e rr y
        Raspberry                                                       Whole fruit

        Other berries                                                   Wi t h t h e c al y x e s r e mo v e d

        J a p a n e s e pe r s i m mo n                                 Wi t h t h e c al y x e s a n d th e s e e d s
                                                                        r e mo v e d
        Wa t e r me l o n , m a k u w a u r i me l o n an d             Wi t h t h e r in d s r e mo v e d
        me l o n s
        Grape                                                           Wi t h t he p ed u n cl e s r emo v e d

        Other fruits                                                    E d i b le p o r t i o n s

        Tu r n i p ( r o o t s ) a n d J a p a n e s e r a d i s h      Wi t h th e d ir t l i g h t l y r in s e d o ff w i t h
        ( r o o t s , i n clu d i ng r a di s h )                       water
        Tu r n i p ( l e a v e s ) , w a t e r c r e s s , k a l e ,    Wi t h t h e d ec a y e d l e av es r e mo v e d
        J a p a n e s e r ad i s h ( l e av es , i n c lu d in g
        radish), and brussels sprouts
        C a u l i f lo w e r a n d b r o c co l i                       Wi t h t h e l ea v e s r e mo v e d

        C a b b ag e an d C h in e s e ca b b ag e                      A s a mp l e c o n s i s t in g o f o n e p o r t io n
                                                                        f r o m e a c h o f f o u r h e ad s , w i t h eac h
                                                                        h e a d e q ua l ly c u t i nt o fo u r p o r ti o ns ,
                                                                        w i t h o u t t h e d e c a y e d o u t e r l e av e s
                                                                        a n d th e co r e s
        Kyona and komatsuna (Japanese                                   Wi t h t h e r o o t s a n d t h e d e c a y e d
        mu s t a r d s p i n a c h )                                    l e a v e s r e mo v e d
        Horseradish                                                     R o o t s w i th t h e d i r t l ig h t l y r i n s e d
                                                                        o ff w i t h w a t e r
        Qing-geng-cai and other                                         E d i b le p o r t i o n s
        c r u c i f e r o u s v e g et a bl e s
        S w e e t p o t ato , k on j ac , ta r o , p o t a t o ,        Wi t h th e d ir t l i g h t l y r in s e d o ff w i t h
        y a m a n d o t h e r p o ta t o es                             water
        P u mp k i n ( i n c l u d i n g s q u a s h ) ,                Wi t h t h e v in e s r e mo v e d
        c u c u mb e r ( i n c lu d in g g h e r k i n ) an d
        o r i e n t al p i ck l i n g me l o n ( v e g et a b le )
        O t h e r c u c u r b i t a c eo u s v e g et a b le s          E d i b le p o r t i o n s

        A r t i c h o k e , e n d iv e an d c h i co r y                Wi t h t h e d ec a y e d l e av es r e mo v e d



                                                               4/100
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from the Japanese Original


        B u r d o ck a n d s a l s i f y                               A s a mp l e t h i n l y s l i ced t h en g r o u n d
                                                                       w i t h a me a t g r i n d e r, t h e l e a v e s
                                                                       h a v in g b e en r e mo v e d a n d th e d i r t
                                                                       h a v in g b e en l i g h t l y r in s e d o ff w it h
                                                                       water
        S h u n g i ku                                                 Wi t h t h e r o o t s a n d t h e d e c a y e d
                                                                       l e a v e s r e mo v e d
        L e t t u ce ( i n c l u d i n g c o s l e t tu c e an d       Wi t h t h e d ec a y e d o u t e r l e a v e s a n d
        l e a f l e tt u c e)                                          t h e co r e s r e mo v e d
        O t h e r c o mp o s i t e v e g eta b l e s                   E d i b le p o r t i o n s

        S h i it a k e mu s h r o o m, b u t t o n                     E d i b le p o r t i o n s
        mu s h r o o m a n d o t h e r mu s h r o o ms
        C e l e r y, p a rs l e y a n d m it s u b a                   Wi t h t h e r o o t s a n d t h e d e c a y e d
                                                                       l e a v e s r e mo v e d
        Carrot and parsnip                                             Wi t h th e d ir t l i g h t l y r in s e d o ff w i t h
                                                                       water
        O t h e r u mb e l l i f e r o u s v eg e t ab l e s           E d i b le p o r t i o n s

        To ma t o , e g g p l an t an d p i mi e n t o                 Wi t h t h e c al y x e s r e mo v e d
        (sweet pepper)
        O t h e r s o l a n c e o u s v e g eta b l e s                E d i b le p o r t i o n s

        Asparagus                                                      St e ms

        O n i o n , g a r li c , w e l s h ( in c l ud i n g lee k ) Wi t h t h e o u t e r s k i n s an d t h e r o o t
        a n d mu l t i p ly i n g o n i o n                          h a i r r e mo v e d
        N i r a a n d o th e r l i l ia c eo u s v e g e t a b le s E d i b le p o r t i o n s

        G r e e n s o y b e a n s , k i d n ey b e a n s               Wi t h t h e p ed i c e l s r e mo v e d
        ( i m ma t u r e , w i t h p o d s ) a n d p e a s
        ( i m ma t u r e , w i t h p od s )
        Okra                                                           Wi t h t h e c al y x e s r e mo v e d

        Sugarcane                                                      Wi t h t he hus k s r e mo v e d

        Ginger                                                         Wi t h t h e l ea v e s r e mo v e d , an d w i th
                                                                       t h e d i r t l ig h t l y r i n s e d o ff w i t h
                                                                       water
        Sugar beet                                                     Wi t h th e d ir t l i g h t l y r in s e d o ff w i t h
                                                                       water
        Spinach                                                        Wi t h r e d r o o t s l e f t o n , a n d w i th t h e
                                                                       r o o t h ai r an d th e d e c ay e d l e a v e s
                                                                       r e mo v e d
        B a mb o o s ho o t s an d o th e r v e g e t ab l e s E d i b le p o r t i o n s



                                                               5/100
Provisional Translation
from the Japanese Original


        S e s a me s e e d s , r a p e s e e d s , s u n f l o w e r     Seeds only
        s e e d s , s a ff l o w e r s e e d s , c o t t o n s e e d s
        a n d o t h e r oi l s e e d s
        A l mo n d , g in k g o n u t , ch e s t n u t ,                 Wi t h t h e h u s k s r e mo v e d
        w a l n u t , p e ca n a n d o t h er n u t s
        C a c a o b e an s a n d co ff e e b e an s                      B e a n s w i t h o u t th e p o d s

        Te a                                                             Te a l ea v e s

        Hop                                                              Dried flowers

        O t h e r s p i c es a n d o t h e r h e r b s                   E d i b le p o r t i o n s


      ( 3 ) 2 , 4 , 5 - T a n a l yt ic al me t h o d
        1. Apparatus
          A g a s c h r oma t o g r a p h w i t h an e lec t r o n c a p tu r e d e t ec t o r ( G C - E C D ) a n d
          a g a s ch r oma t o g r a p h /ma s s s p e c t r o me t e r ( G C / M S o r G C / M S / M S ) .
        2 . R e ag e n t s a n d t e s t s o l u t io n s
          I n a d d i t io n t o t h e r e ag e n t s a n d te s t s o lu t i o n s l i s t ed b e l o w, u s e th o s e
          l i s t e d in S e c t i o n C R e a g e n ts /Te s t S o l u ti o n s , E t c . , P a r t I I F o o d
          a d d it i v e s . R e a g en t s d e s i g n at e d as “s p e c i a l g r a d e ” i n th i s s e c ti o n mu s t
          me e t t h e re q u i r e me n t s f o r “s p e c i a l g r a d e” s p e c i f ie d i n t h e J ap a n
          I n d u s t r i a l St a n d a r d s fo r t h e r e ag e n t s .
          A c e t o n it r i le : U s e a r o ta r y v a c u u m e v a p o r a t o r o n 3 0 0 mL o f a c e to n i t ri l e
             t o c o n c e n t r a t e t o t h e p o i n t o f d r y n e s s . D i s s o l v e t h e r e s id u e i n 5 mL o f
             n - h e x an e . F o r a n a l y s i s , i n j ec t 5 μ L o f th e so l u ti o n i n to a GC -ECD.
             P e a k s o t h er t h a n t h a t o f n - h e x an e i n th e r e s u l t i n g ch r o ma t o g r a m
             s h o u ld b e as h i g h a s o r l o w e r t h an t h e p e a k s o f γ - B H C a t 2 x 1 0 - 1 1 g .
          A c e t o n e: U s e a r o t a r y v a cu u m e v a p o r at o r o n 3 0 0 mL o f a c et o n e to
             c o n c en t r a t e t o t h e p o in t o f d r y n e s s . D i s s o l v e t h e r e s i d u e i n 5 mL o f
             n - h e x an e . F o r a n a l y s i s , i n j ec t 5 μ L o f th e so l u ti o n i n to a GC -ECD.
             P e a k s o t h er t h a n t h a t o f n - h e x an e i n th e r e s u l t i n g ch r o ma t o g r a m
             s h o u ld b e as h i g h a s o r l o w e r t h an t h e p e a k s o f γ - B H C a t 2 x 1 0 - 1 1 g .
          E t h e r : U s e a r o ta r y v a cu u m e v a p o r a t o r o n 3 0 0 mL o f e t h e r t o
             c o n c en t r a t e t o t h e p o in t o f d r y n es s . D i s s o l v e t h e r e s i d u e i n 5 mL o f
             n - h e x an e . F o r a n a l y s is , i n je c t 5 μ L o f t h e s o l u t i o n i n t o a GC -E C D .
             P e a k s o t h er t h a n t h a t o f n - h e x an e i n t h e r e s u l t i n g ch r o ma t o g r a m
             s h o u ld b e as h i g h a s o r l o w e r t h an t h e p e a k s o f γ - B H C a t 2 x 1 0 - 1 1 g .
          S o d i u m c h l o r i d e : S o d iu m c h l o r i de ( s p e c i a l g r a d e ) . I f t h e r e a g e n t i s
             f o u n d to in c l u d e a n y s u b s t a nc e tha t ma y i n t e r f e r e w i t h t h e a n al ys i s o f



                                                               6/100
Provisional Translation
from the Japanese Original


            s u b s t a n ce s t o b e an a l yz e d f r o m a g r i c u l tu r a l c h e mi c a l s , w a s h w i t h a
            s o l v e n t s u ch a s n - h e x a n e b e f o r e u s e .
          S y n t h e t i c ma g n e s i u m s i l i c a t e (F l o r i s i l ) f o r c o l u mn c h r o ma t o g r a p h y :
            H e a t f l o r i s i l ( 1 5 0 - 2 5 0 μ m i n p a r tic l e s iz e ) at 1 3 0 ° C f o r 1 2 h o u r s o r
            l o n g e r. C o o l d o w n t o ro o m t e mp e r a t u r e in a d e s i c c a to r.
          D i a t o ma c e o u s e a r t h : D i a t o ma c e o u s e a rt h f o r c h e mi c a l a n a l y s i s . .
          E t h yl a c et at e : U s e a r o t a r y v a cu u m e v a p o ra t o r o n 3 0 0 mL o f e t h y l
            a c e t a te t o co n c en t r a t e t o t h e p o in t o f d r y n e s s . D i s s o l v e th e r e s i d u e in
            5 mL o f n - h e x an e . F o r a n a l y s i s , i n j e ct 5 μL o f t h e so l u ti o n i n to a
            GC-ECD.            P e a k s o t h e r t h a n th a t o f n -h e x an e in t h e r e s u lt i n g
            c h r o ma t o g r a m s h o u l d b e a s h i g h a s o r l o w e r t h a n t he pe a k s o f γ - B H C
            a t 2 x 10 - 1 1 g .
          R e a g en t f o r b u t y l e s te r i f i c a t i o n : D i s s o l v e 1 0 g o f b o r o n t r i f l u o r i d e
            e t h e r co mp l e x in 2 5 ml o f n - b u t an o l .
          n - H e x a n e : U s e a r o t a r y v a c u u m e v a p o r at o r on 3 00 mL o f n - h e x a n e t o
            e v a p o r a t e u n t i l 5 mL i s l e f t . F o r a n a l y s i s , i n j e c t 5 μ L o f t h e s o lu t io n
            i n t o a G C - E C D . P e a k s o t h e r th an t h at o f n - h e x a n e i n t h e r e s u l t in g
            c h r o ma t o g r a m s h o u l d b e a s h ig h a s o r lo w e r t h an t h e pe a k s o f γ - B H C
            a t 2 x 10 - 1 1 g .
          Wa t e r : D i s ti l l e d w a t e r. I f t h e d i s ti l l e d w a t e r i s f o u n d to i n c l u d e an y
            s u b s t a n ce th a t ma y i n t e r f e r e w i t h a n a l y s i s o f t h e t a rg et co mp o s i t i o n a l
            s u b s t a n ce s f r o m a g r i c u l t u r a l ch emi c a l s , w a s h w i t h a s o l v en t s u c h a s
            n-hexane before use.
          S o d i u m s u l f a t e ( a n h y d r o u s ) : S o d iu m s u l f a t e ( a n h y d r o u s) ( s p e c i a l g ra d e ) .
            I f t h e r e a g e n t i s f o u n d t o in c lu d e a n y s u b st a n c e t h at ma y i n t e r f e r e
            w i t h a n al y s i s o f t h e t a rg e t co mp o s i t i o n a l s u b st a n c e s f r o m a g r i c u l t u r al
            c h e mi c a l s , w a s h w i t h a s o l v en t su c h a s n - h e x a n e b e f o r e u s e .
          M e t h an o l: U s e a r o t a r y v a c u u m e v a p o r at o r on 3 00 mL o f me t h a n o l t o
            c o n c en t r a t e t o t h e p o in t o f d r y n e s s . D i s s o l v e t h e r e s i d u e i n 5 mL o f
            n - h e x an e . F o r a n a l y s i s , i n j ec t 5 μ L o f th e so l u ti o n i n to a GC -ECD.
            P e a k s o t h er t h a n t h a t o f n - h e x an e i n th e r e s u l t i n g ch r o ma t o g r a m
            s h o u ld b e as h i g h a s o r l o w e r t h an t h e p e a k s o f γ - B H C a t 2 x 1 0 - 1 1 g .
        3. Reference standard
          2 , 4 , 5 - T: Thi s p r o du c t c o n ta i n s n o t l e s s t h an 9 8 % o f 2 , 4 , 5 - T, a n d i t s
            me l t i n g p o in t i s 1 5 6 ° C.
        4. Procedure
          a . E x t r a ct io n



                                                              7/100
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            i . C e r e a l g r a i n s , l eg u me s / p u l s e s an d s e ed s
              We i g h 1 0. 0 g o f th e te s t s a mp l e , p r e v io u s l y g r o u n d s o a s to p a s s
              t h r o u g h a s t a n d a r d me s h s i e v e ( 42 0 µ m) . A d d 2 0 ml o f w a t e r t o t he
              o b t ai n ed s amp l e a n d l ea v e it t o s ta n d f o r t w o h o u r s .
              T h e n , a d d 1 0 0 ml o f ac e t o n e an d 5 ml o f 4 mo l / l h y d r o c h lo r i c aci d ,
              and      h o mo g e n iz e          the       mi x t u r e      for      three        mi n u t e s .   Filter      the
              h o mo g e n i z e d s a mp l e b y s u c t io n i n to a r o ta r y v a c u u m e v a p o r a to r
              through         a     filter        paper        c o v e r ed       with      a      1-cm      thick       layer     of
              d i a to ma c e o u s e a r t h . Co l l e ct t h e re s i d u e o n th e s u r f a c e o f t h e f i lt er
              p a p e r. A d d 5 0 ml o f ac e t o n e an d h o mo g e n i z e t h e mi x t u r e f o r t h r e e
              mi n u t e s . Re p e a t t he ab o v e p r o c ed u r e an d co mb i n e th e f i l t r a t e i n to
              t h e r o ta r y v a c u u m e v a p o r a t o r, a n d co n ce n t r a t e t h e mi x t u r e t o
              a p p r o x i ma t e l y 3 0 ml a t 4 0 ° C o r lo w e r.
              Tr a n s f e r t h e c o n c en t ra t e d s o lu t io n t o a 3 0 0 - ml s e p a r a t i n g f u n n e l
              a l r e a d y c on t a in i ng 10 0 ml o f 1 0 % s o d iu m c h l o r id e s o l u t io n . Wa sh
              t h e eg g p l an t - s h a p ed fl a s k o f th e a b o v e r o ta r y v a c u u m e v a p o r a to r
              w i t h 1 00 ml o f e th yl ac e t a t e a n d a d d t h e w as h i n g s t o th e s e p a r at in g
              f u n n e l a b o v e . S h a k e th e mi x t u r e v i g o r o u s l y f o r f i v e mi n u t e s u si n g a
              s h a k e r a nd l e a v e t h e f u n n e l t o st a n d , a n d th e n t r an s f e r t h e e t h y l
              a c e t a te l a ye r t o a 3 0 0 -ml c o n i c a l f l a s k . A d d 5 0 ml o f e t h y l a c e t at e t o
              t h e aq u eo u s l a y e r a n d r e p e a t t h e a b o v e p r o ce d u r e , a n d t h e n a d d th e
              e t h y l a c e tat e l a y e r t o t h e c o n i ca l f l a s k a b o v e . A d d a n a d eq u ate
              a mo u n t o f s o d i u m s u l f a t e ( a n h y d r o u s ) t o th e f l a s k an d l e a v e it to
              s t a n d f o r 1 5 mi n u t e s w i t h o cc a s io n a l s h a k i n g . F i l te r t h e c o n t en t o f
              t h e f l a s k i n t o a r o ta r y v a c u u m e v ap o r a t o r. Was h t h e f l a sk w i t h 2 0 ml
              o f e t h y l a c e t a t e an d w a s h t w i c e t h e r e s i d u e o n t h e su r f a c e o f t h e
              f i l t e r p ap e r w i t h t h e w a s h i n g s . A d d t h e wa s h i n g s i n to th e r o ta r y
              v a c u u m e v a p o r a to r a n d c o n c e n t r at e t h e mi x t u re t o a p p r o x i ma t e l y 1
              ml a t 4 0 ° C o r l o w e r, an d th e n e v ap o r a t e t h e s o l v e n t to n e a r d r y n e s s
              i n a n i t r o g en s t r e a m a t r o o m t e mp e r a t u r e .
              A d d 3 0 ml o f n - h ex a n e to th e d r ie d r e s id u e a n d t r a n s f er t h e mi x t u r e
              t o a 10 0 - ml s e p a r a t in g f u n n e l , an d th e n ad d 3 0 ml o f n - h e x an e -
              saturated           a c e t o n i t r i le.   Shake          th e     mi x t u r e    v i g o r o u sl y   for     five
              mi n u t e s u s i n g a s h a k e r a n d le av e t h e f u n n e l to s t an d , a n d th en
              t r a n s f e r t h e a c e t o n i t r i le l a y e r t o a 2 0 0 - ml s e p a r a t i n g f u n n e l . A d d 3 0
              ml o f n - h e x a n e - s a tu r a t e d a c et o n it r i l e t o t h e n - h e x an e l a y e r a n d
              r e p e a t t h e a b o ve p r oce d u r e t w i c e, a n d th e n c o mb i n e th e a c et o n i t r il e



                                                                8/100
Provisional Translation
from the Japanese Original


              l a ye r t o t h e s e p a r a t in g f u n n e l a b o v e . A d d 5 0 ml o f n - h e x a n e-
              s a t u r a t e d ac e t o n i t r i l e i n t o t h e s ep a r a t i n g f u n n e l a n d s h a k e l i g h t ly,
              a n d th e n l ea v e th e f u n n e l to s t a n d . Tr a n s f e r t h e a ce t o n i t r i l e l a y e r
              i n t o a r o tar y v a c u u m e v ap o r a t o r a n d co n ce n t r a t e t h e mi x t u r e to
              a p p r o x i ma t e l y 1 ml a t 4 0 ° C o r l o w e r, a n d t h e n ev a p o r a te t h e s o lv en t
              t o n ea r d r yn e s s i n a n it r o g e n st r e a m a t r o o m t e mp e r a t u r e .
            i i . F r u i t , v eg e t ab l e s , ma t c h a a n d h o p s
              I n c a s e o f f r u i t a n d ve g e t ab l e s , w e i g h ac c ur a t e l y a b out 1 k g o f th e
              t e s t s a mp l e a n d a d d an a p p r op r i a te a mo u n t of w a t e r t o th e s a mp l e , i f
              r e q u i r e d . H o mo g e n i ze       the     mi x t u r e    an d me s u r e         out     a s a mp l e
              e q u iv a l en t t o 2 0 . 0 g .
              I n c a s e o f ma t c h a , w e i g h 5 . 0 0 g o f t h e t e s t s a mp l e a n d a d d 2 0 ml o f
              w a t e r, a n d t h e n l e av e i t t o s t a n d f o r t w o h o u r s .
              I n c a s e o f h o p s , w e ig h 5 .0 0 g o f t h e te s t s amp l e , p r e v io u s l y g r o un d ,
              a n d ad d 2 0 ml o f w a t e r, a n d t h en le a v e it to st a n d f o r t wo h o u r s .
              T h e n , a d d 1 0 0 ml o f ac e t o n e an d 5 ml o f 4 mo l / l h y d r o c h lo r i c aci d ,
              and      h o mo g e n iz e       the     mi x t u r e       for    three       mi n u t e s .    Filter       the
              h o mo g e n i z e d s a mp l e b y s u c t io n i n to a r o ta r y v a c u u m e v a p o r a to r
              through         a    filter     paper        c o v e r ed      with     a    1-cm       thick       layer      of
              d i a to ma c e o u s e a r t h . Co l l e ct t h e re s i d u e o n th e s u r f a c e o f t h e f i lt er
              p a p e r an d a d d 5 0 ml o f a c e to n e , a n d t h en h o mo g e n i z e t h e mi x t u r e
              f o r t h r e e mi n u t e s . R e p e a t th e a b o v e p r o ce d u r e a n d c o mb i n e t h e
              f i l t r a t e in t o t h e r o t a r y v a c u u m e va p o r a to r, an d th e n c o n c e n t r a t e th e
              mi x t u r e t o a p p r o x i ma t e l y 3 0 ml a t 4 0 ° C o r lo w e r.
              Tr a n s f e r t h e c o n c e n t r a t e d so l ut io n to a 3 0 0 - ml s e p a r a t i n g f u n n e l
              a l r e a d y c on t a in i ng 1 0 0 ml o f 1 0 % s o d i u m c h l o r id e s o l u t io n . Wa sh
              t h e e g g p lan t - s h a p ed f l a s k o f t h e a b o v e r o ta r y v a c u u m e v a p o r a t o r
              w i t h 1 00 ml o f e t h yl ac e t a t e a n d a d d th e w as h i n g s to th e s e p a r a tin g
              f u n n e l ab ov e . S h a k e th e mi x t u r e v i g o r o u s l y f o r f i v e mi n u t e s u s in g a
              s h a k e r a n d l e a v e th e f u n n e l to s t a n d , an d th e n t r a n s f er t h e e t h y l
              a c e t a te l a ye r t o a 3 0 0 - ml c o n i c a l f l a s k . A d d 5 0 ml o f e t h y l a c e t a te t o
              t h e a qu e ous l a ye r a n d r e p e a t t h e a b o v e p r o c e d u r e t w ic e , a n d th en
              c o mb i n e th e e t h y l ac et a t e la y e r t o t h e c o n i ca l f l a s k ab o v e . A d d an
              a d e q u a t e amo u n t o f so d i u m s u l f a t e ( a nh ydr o u s ) t o t he f l a s k a nd
              l e a v e i t t o s t a n d f o r 1 5 mi n u t e s w i t h o c c a s io n a l s h ak i n g . F i l te r t h e
              c o n te n t o f th e f l a s k in to a r o t a r y v a c u u m e v a p o r a t o r. Wa s h th e f l a sk
              w i t h 2 0 ml o f e th y l a c e t a te an d w a s h t wi c e th e r e si d u e o n t h e



                                                            9/100
Provisional Translation
from the Japanese Original


              s u r f a c e o f th e f i l t e r p ap e r w i t h th e w a s h i n g s . A d d t h e wa s h i n g s i n to
              t h e r o t a r y v a c u u m e v a p o r a t o r a n d co n ce n t r a t e th e mi x t u r e t o
              a p p r o x i ma t e l y 1 ml a t 4 0 ° C o r l o w e r, a n d th e n e v a p o r ate t h e s o l v en t
              t o n ea r d r yn e s s i n a n it r o g e n st r e a m a t r o o m t e mp e r a t u r e .
            i i i . Te a s o th e r t h an ma t c h a
              We i g h 9 .0 0 g o f t h e te s t s a mp l e a n d s o ak i t i n 5 4 0 ml o f w a t e r a t
              1 0 0 ° C , an d t h e n l e av e i t t o s t an d a t r o o m t e mp e r a t u r e f o r f i v e
              mi n u t e s . Tr a n s f e r 3 6 0 ml o f t h e c o o l ed f i l t r at e i n to a 5 0 0 - ml c o n i c a l
              f l a s k a n d ad d 1 8 g o f s o d i u m c h l o r i d e an d 4 mo l / l h y d r o c h lo r i c a ci d
              t o a d ju s t the p H t o 1 o r l o w e r. Tr a n s f e r t h e s o l u t io n to a 1 , 0 0 0 -ml
              s e p a r a t i ng f u n n e l a l r ea d y c o n t a i n i n g 1 0 0 ml o f e t h y l ace t a t e . S h a k e
              t h e mi x t u r e v i g o r o u s l y f o r f i v e mi n u t e s u s i n g a s h ak e r an d le a v e th e
              f u n n e l to s ta n d , an d t h e n t r a n s f e r t h e e th y l a c e t a t e l a y e r t o a 3 0 0 - ml
              c o n ic a l f l as k . A d d 1 0 0 ml o f e t h y l a c e t a te to t h e aq u eo u s l a y e r a nd
              r e p e a t th e a b o v e p r o ce d u r e t w i ce , a n d co mb i n e t h e e th y l a c e t at e
              l a ye r t o t he c o n ic a l f l as k a b ov e . A d d a n ad eq u a te a mo u n t o f s odium
              s u l f a t e ( an h y d r o u s ) t o t h e f l a s k an d l e av e i t t o s ta n d f o r 1 5 mi n u t e s
              w i t h o c ca s io n a l s h a k in g . F i l t e r t h e c o n t e n t o f t h e f l a s k i n t o a r o t a ry
              v a c u u m e v a p o r a to r. Wa s h t h e f l as k w i t h 2 0 ml o f e t h y l a c e t a t e an d
              w a s h t w i c e t h e r e s i d u e o n t h e s u r fa c e o f t h e f i l t e r p a p e r w i t h t h e
              w a s h i n g s . A d d t h e w as h i n g s i n to t h e r o t a r y v a c u u m e v a p o r a to r a n d
              c o n c en t r a t e t h e mi x t u r e t o a p p r o x i ma t e l y 1 ml a t 4 0 ° C o r l o w e r, an d
              t h e n ev a p o r a t e t h e s o l v e n t t o n ea r d r y n e s s i n a n i t r o g e n s t r e a m a t
              r o o m t e mp e r a t u r e .
            i v. F o o d s o t h e r t h a n th o s e l i s t ed in i to i ii a b o v e
              O b t a i n t h e e x t r a c t s acc o r d i n g to t h e me t h o d s d e s c r i b e d i n i o r i i .
          b. Hydrolysis
            D i s s o l v e t he r e s i d u e ob t a in e d b y t h e e x t r a c t io n d e s c r ib ed i n 4 - a in 2 0
            ml o f me t h a n o l a n d t ra n s f e r t h e mi x t u r e t o a 1 00 - ml e g g p la n t - s h ap e d
            f l a s k , a n d t h e n a d d 1 0 ml o f 1 .5 mo l / l s o d i u m h y d r o x i d e s o l u t io n .
            A t t a c h a r ef l u x co n d en s e r t o t h e fl a s k a n d h e a t t h e m i x t u r e fo r 3 0
            mi n u t e s i n a w a t e r b a th a t 8 0 ° C, a n d t h e n a ll o w i t t o co o l . Tr a n s fe r
            t h e so l u t i o n in t o a r o ta r y v a c u u m e v ap o r a to r a n d r e mo v e mo s t o f th e
            me t h a n o l at 4 0 ° C o r l o w e r. F i l t e r t h e r e s i d u e b y s u c t i o n in t o a 3 0 0 -ml
            s e p a r a t i n g f u n n e l ( I ) t h r o u g h a g l a s s f i l t e r ( p o r e s i z e G 3 ) . Wa s h t h e
            r e s i d u e o n t h e g l a s s f il t e r w i t h a s ma l l a mo u n t o f a c et o n e an d w a te r
            a n d a d d th e w a s h i n g s to t he s ep a r a t i ng f u nn el a bo v e , and t he n a dd 5 0



                                                          10/100
Provisional Translation
from the Japanese Original


            ml o f e t h e r a n d 1 0 0 ml o f 1 0 % s o d i u m c h l o r i d e s o l u tio n . S h a k e th e
            mi x t u r e v i g o r o u s l y fo r f i v e mi n u t e s u s in g a s h a k e r a n d l e av e it to
            s t a n d . Tr a ns f e r t h e aqu e o u s l a y e r t o a 3 0 0 -ml s e p a r a t in g f u n n el (I I )
            a n d a d d 4 mo l / l h y d r o c h l o r i c a c id t o a d ju s t t h e p H t o 1 o r l o w e r. A d d
            5 0 ml o f e t h y l a c e t at e t o t h e a d j u s t e d s o lu t io n a n d s h a k e t h e mi x t u r e
            v i g o r o u s l y f o r f i v e mi n u t e s u s i n g a s h ak e r, an d th e n l eav e it to s t an d .
            Tr a n s f e r t h e e t h yl a c e ta t e l a y e r t o a 3 0 0 - ml c o n i ca l f l a s k . A d d 5 0 ml
            o f e t h y l a ce t a t e t o t h e a q u e o u s l ay e r a n d r e p e a t th e a b o v e p r o c e d u r e ,
            a n d th e n co mb i n e t h e e t h y l a c e ta t e l a y e r t o t h e c o n i c al f l a s k a b o v e.
            A d d a n ad eq u a te a mo u n t o f s od i um s u l f a t e ( a n h yd r o u s ) t o th e f l a sk
            a n d l e av e it t o s t an d fo r 1 5 mi n ut e s w i t h o cc a s i o n a l s h a k i n g . F i lte r
            t h e co n te n t o f t h e f las k i n to a ro t a r y v a c u u m e v a p o ra t o r. Wa s h t h e
            f l a s k w i t h 2 0 ml o f e t h y l a c e t a te a n d w a s h t w i c e t h e re s i d u e o n th e
            s u r f a c e o f t h e f il t e r p a p e r w i t h th e w a s h in g s . A d d t h e w a s h i n g s in t o
            the      rotary        v a cu u m e v a p o r a t o r   and      co n c e n t r a t e   th e   mi x t u r e    to
            a p p r o xi ma t e l y 1 ml a t 4 0 ° C o r lo w e r.
          c . B u t y l e s te r i f i c a t i o n
            Tr a n s f e r t h e s o l u t io n o b t ai n ed b y t h e h y d r o ly s i s d e s c r i b e d i n 4 - b to a
            2 0 - ml e g g p l a n t - s h ap e d f l a s k an d t h e n e v a p o r a t e t h e s o l v e n t to n ea r
            dryness          in     a    nitrogen      s t r e a m a t r o o m t e mp e r a t u r e . A f t e r           the
            d e s i c c at i o n , a d d 1 ml o f a b u t y l e st e r i f i c a te d a g e n t t o t h e r e s i d u e .
            A t t a c h a r e f l u x co n d e n s e r t o th e e g g p l a n t - s h a p e d f l a s k d e s c r ib e d
            a b o ve an d h e a t t h e mi x t u r e f o r 3 0 mi n u t e s in a w a te r b a t h at 9 0 ° C,
            a n d a ll o w i t t o co o l . Tr a n s f e r t h e mi x t u r e t o a 2 0 0 - ml s e p a r a t i n g
            f u n n e l a l r ea d y c o nt a ini n g 5 0 ml o f 1 0 % s o d iu m c h l o r i d e s o l u t i o n an d
            5 0 ml o f n - h e x an e an d s h a k e t he mi x t u r e v i go r o u s l y f o r f i v e mi n u t e s
            u s i n g a s h ak e r, a n d th en l ea v e i t to s t a n d . Tr a n s f e r t h e n - h e x an e l aye r
            t o a 2 0 0 - ml c o n i c al f la s k a nd add 50 ml o f n - h e x an e to t h e aq u eo u s
            l a ye r a n d r e p e a t th e ab o v e p r o c ed u r e , a n d th e n c o mb i n e t h e n - h ex a n e
            l a y e r t o t h e c o n ic a l f la s k a b ov e . A d d a n a d eq u a te a mo u n t o f s o d iu m
            s u l f a t e ( a n h y d r o u s ) t o t h e f l a s k an d l e av e i t t o s t a n d fo r 1 5 mi n u t e s
            w i t h o cc a s io n a l s h a k i n g . F i l t e r t h e c o n t e n t o f t h e f l a s k i n t o a r o ta r y
            v a c u u m e v a p o r a to r. Wa s h t h e f l a sk w i t h 1 0 ml o f n - h e x a n e an d wa s h
            t h e r e s i d u e o n t h e s u rf a c e o f t h e f i l t e r p a p e r w i t h t h e wa s h i n g s . Ad d
            t h e w a s h i n g s t o t h e r o t a r y v a c u u m e v a p o r a t o r a n d co n c en t r a t e t h e
            mi x t u r e t o a p p r o x i ma t e l y 2 ml a t 4 0 ° C o r lo w e r.
          d . C l ea n - u p



                                                          11/100
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from the Japanese Original


            A d d 5 g o f f l o r i s i l f o r c o l u mn c h r o ma t o g r a p h y s u s p e n d ed i n n - h ex an e
            i n t o a c h ro ma t o g r a p h t u b e ( 1 5 m m i n i n n e r d i a me t e r, 3 0 0 mm i n
            l e n gt h ) a nd a d d ov e r ap p r o x i ma t e l y 5 g o f s o d i u m s u l f a t e ( a n h y d r o u s )
            i n t o th e c o l u mn . S p i l l o u t t h e n -h e x an e u n ti l o n l y a s ma l l a mo u n t
            r e ma i n s o n t h e p a ck i ng o f t h e co l u mn a n d p o u r t h e s o l u tio n o b t ai n ed
            b y t h e b u t y l e s t e r i f i c at i o n d e s c r ib e d in 4 - c i n t o t h e c o lu mn . P o u r 5 0
            ml o f e t h e r / n - h e x a n e (1 : 1 9 ) i n to th e co l u mn a n d d i s c a r d t h e e ff l u e n t .
            P o u r 1 5 0 ml o f e t h e r / n - h e x a n e (3 :1 7 ) i n to t h e c o lu mn a n d c o l l e ct th e
            e l u a te i n to a r o t a r y v a c u u m e v ap o r a t o r. C o n c e n t r a t e th e mi x t u r e t o
            a p p r o xi ma t e l y 1 ml a t 4 0 ° C o r lo w e r a n d e v a p o r a t e t h e s o l v e n t to n e a r
            d r y n e s s i n a n i t r o g en s t r e a m a t r o o m t e mp e r a t u r e . D i s s o l v e t h e
            r e s i d u e i n n - h e x an e t o ma k e e x a ct l y 1 0 ml o f s o l u t io n , w h i c h i s u se d
            a s t h e s a mp l e s o lu t i o n .
        5 . D e t e r mi n a t io n
          a . Q u a l i ta t iv e t e s t s
            P e r f o r m q u a l i t at i v e t es t s u n d e r th e f o l l o w in g c o n d i t io n s . Te s t r e s u l t s
            o b t ai n ed mu s t b e t h e s a me a s t h o s e o b t a i n ed f o r t h e r e f e r e n c e
            s t a n d a r d u n d e r t h e p r o c e d u r e d e s cr i b e d in 4 -c .
            Te s t i n g c o n d i t io n s
            C o l u mn : A s i l i c a te g l as s c a p i ll a r y c o lu mn ( 0 . 2 5 mm i n i n n e r d i a me t e r,
              3 0 m i n len g t h ) c o a te d w i th 5 % p h e n y l me t h y l s i l ic o n e f o r g a s
              c h r o ma t o g r a p h y t o a th i c kn e s s o f 0 . 2 5 µ m.
            C o l u mn t e mp e r a t u r e : H o l d t h e c o l u mn t e mp e r a t u r e a t 5 0 ° C f o r o n e
              mi n u t e , f o ll o w e d b y an i n c r e a s e o f 2 5 ° C ev er y mi n u t e u n t i l r e ac h in g
              1 2 5 ° C , a f t er w h i c h in cr e a s e t h e te mp e r a t u r e b y 1 0 ° C ev e r y mi n u t e
              u n t il r e a c h in g 3 0 0 ° C , a n d h o ld f o r f i v e mi n u t e s .
            I n l e t t e mp e r a t u r e : 2 6 0 ° C
            D e t e c t o r : Op e r a t e at 3 0 0 ° C .
            Gas flow rate: Use nitrogen or helium as the carrier gas. Adjust the
              f l o w r a t e s o t h a t n - b u t y l ( 2 , 4 ,5 - tr i c h l o r o p h en o x y ) a c et at e f l o w s o u t
              i n a p p r o x ima t e l y 1 5 mi n u t e s .
          b . Q u a n ti t at i v e t e s t s
            D e t e r mi n e t h e q u a n ti t y f r o m t h e t e s t r e su l t s o b t a in e d u n d e r th e
            c o n d i t io n s d e s c r i b ed in 5 - a u si n g e i t he r t h e p e a k h e ig h t o r p e ak a re a
            me t h o d .
          c . C o n f i r ma t i o n t e s t s
            P e r f o r m g a s c h r o ma t o g r a p h y / ma s s s p e c t ro me t r y u n d e r t h e s am e



                                                            12/100
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            c o n d i t io n s a s t h o s e d e s c r i b e d i n 5 - a . Te s t r e s u l t s o b ta i n ed f o r th e
            r e f e r e n c e s t a n d a r d mu s t b e th e s a me a s t h o s e o b t a in e d u n d e r th e
            p r o c e d u r e d e s c r i b ed in 4 - c . D e t er mi n e t h e q u a n t i t y u si n g e it h e r th e
            p e a k h e ig h t o r p e ak a re a me t h o d , i f r e q u i r e d .

      ( 4 ) A n a l yt i c a l me t h o d f o r a z o c y c lo t i n a n d c y h e x at i n
        1. Apparatus
          A g a s c h r o ma t o g r a p h w i t h a f l a me p h o t o me t r i c d e t e c t o r ( G C - F P D ,
          i n t e r f e r e n ce f i l t e r f o r t i n d e t e r mi n a t io n , w a v e l e n g t h : 6 1 0 n m) a n d a g a s
          c h r o ma t o g r a p h / ma s s s p e c t r o me t e r ( G C / M S o r G C / M S / M S ) .
        2 . R e ag e n t s a n d t e s t s o l u t io n s
          I n a d d i t io n t o t h e r e ag e n t s a n d te s t s o lu t i o n s l i s t ed b e l o w, u s e th o s e
          l i s t e d in S e c t i o n C R e a g e n ts /Te s t S o l u ti o n s , E t c . , P a r t I I F o o d
          a d d it i v e s . R e a g en t s d e s i g n at e d as “s p e c i a l g r a d e ” i n th i s s e c ti o n mu s t
          me e t t h e re q u i r e me n t s f o r “s p e c i a l g r a d e” s p e c i f ie d i n t h e J ap a n
          I n d u s t r i a l St a n d a r d s fo r t h e r e ag e n t s .
          A c e t o n it r i le : U s e a r o ta r y v a c u u m e v a p o r a t o r o n 3 0 0 mL o f a c e to n i t ri l e
            t o c o n c e n t r a t e t o t h e p o i n t o f d r y n e s s . D i s s o l v e t h e r e s id u e i n 5 mL o f
            n - h e x an e . F o r a n a l y s i s , i n j ec t 5 μ L o f th e so l u ti o n i n to a GC -ECD.
            P e a k s o t h er t h a n t h a t o f n - h e x an e i n th e r e s u l t i n g ch r o ma t o g r a m
            s h o u ld b e as h i g h a s o r l o w e r t h an t h e p e a k s o f γ - B H C a t 2 x 1 0 - 1 1 g .
          A c e t o n e: U s e a r o t a r y v a c u u m e v ap o r at o r o n 3 0 0 mL o f a c e t o n e t o
            c o n c en t r a t e t o t h e p o in t o f d r y n es s . D i s s o l v e t h e r e s i d u e in 5 mL o f
            n - h e x an e . F o r a n a l y s i s , i n j e c t 5 μ L o f t h e so l u ti o n i n to a G C - E C D .
            P e a k s o th er t h a n t h a t o f n - h e x an e in th e r e s u l t i n g ch r o ma t o g r a m
            s h o u ld b e as h i g h a s o r l o w e r t h an t h e p e a k s o f γ - B H C a t 2 x 1 0 - 1 1 g .
          3 mo l / l e th y l ma g n e s i u m b r o mi d e - e t h e r e a l s o l u t io n : 3 mo l / l e t h y l
            ma g n e s i u m b r o mi d e - e t h e r e a l s o l u t i o n .
          E t h e r : U s e a r o t a r y v a c u u m e v a p o r a t o r o n 3 0 0 mL o f e t h e r t o
            c o n c en t r a t e t o t h e p o in t o f d r y n e s s . D i s s o l v e t h e r e s i d u e i n 5 mL o f
            n - h e x an e . F o r a n a l y s i s , i n j ec t 5 μ L o f th e so l u ti o n i n to a GC -ECD.
            P e a k s o t h er t h a n t h a t o f n - h e x an e i n th e r e s u l t i n g ch r o ma t o g r a m
            s h o u ld b e as h i g h a s o r l o w e r t h an t h e p e a k s o f γ - B H C a t 2 x 1 0 - 1 1 g .
          S o d i u m c h l o r i d e : S o diu m c h l o r i d e ( s p e c i a l g r a d e ) . I f t h e r e a g en t i s
            f o u n d to i nc l u de a n y s u b s t a n c e t h a t ma y i n t er f e r e w i t h t h e a n al y s i s o f
            s u b s t a n ce s t o b e a n al y z e d f r o m a g r i c u l tu r a l c h e mi c a l s , w a s h w i t h a
            s o l v e n t s u ch a s n - h e x a n e b e f o r e u s e .
          S y n t h e t i c ma g n e s i u m s i l i c at e (F l o r i s i l ) f o r c o l u mn c h r o ma t o g r a p h y:


                                                            13/100
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            H e a t f l o r i s il ( 1 5 0 -2 5 0 μ m i n p a r t ic l e s i ze ) a t 1 3 0 ° C f o r 1 2 h o u r s o r
            l o n g e r. C o o l d o w n t o ro o m t e mp e r a t u r e in a d e s i c c a to r.
          D i a t o ma c e o u s e a r t h : D i a t o ma c e o u s e a r t h f o r c h e mi c a l a n a l y s i s .
          C y h e x a t in s t a n d a r d s o l u t io n : A d d a c e ti c a ci d / e th y l a ce t a t e ( 1 :9 9 ) t o
            1 0 . 0 mg o f c y h e x a ti n t o ma k e a 1 0 0 - ml s o l u t i o n . Tak e o u t 1 0 ml o f
            t h e s o l u t io n a n d a d d n - h e x a n e t o ma k e 1 0 0 ml o f mi x .
          S o d i u m d o d e c y l s u l f a t e : S od i u m d o d ec yl s u lf a t e w i t h a p u r it y o f 8 5%
            o r h i g h e r.
          n - H e x a n e : U s e a r o t a r y v a c u u m e v a p o r at o r on 3 00 mL o f n - h e x a n e t o
            e v a p o r a t e u n t i l 5 mL i s l e f t . F o r a n a l y s i s , i n j e c t 5 μ L o f t h e s o lu t io n
            i n t o a G C - E C D . P e a k s o t h e r th an t h at o f n - h e x a n e i n t h e r e s u l t in g
            c h r o ma t o g r a m s h o u l d b e a s h ig h a s o r lo w e r t h an t h e pe a k s o f γ - B H C
            a t 2 x 10 - 1 1 g .
          Wa t e r : D i s ti l l e d w a t e r. I f t h e d i s ti l l e d w a t e r i s f o u n d to i n c l u d e an y
            s u b s t a n ce th a t ma y i n t e r f e r e w i t h a n a l y s i s o f t h e t a rg et co mp o s i t i o n a l
            s u b s t a n ce s f r o m a g r i c u l t u r a l ch emi c a l s , w a s h w i t h a s o l v en t s u c h a s
            n-hexane before use.
          S o d i u m s u l f a t e ( a n h y d r o u s ) : S o d iu m s u l f a t e ( a n h y d r o u s) ( s p e c i a l g ra d e ) .
            I f t h e r e a g e n t i s f o u n d t o in c lu d e a n y s u b st a n c e t h at ma y i n t e r f e r e
            w i t h a n al y s i s o f t h e t a rg e t co mp o s i t i o n a l s u b st a n c e s f r o m a g r i c u l t u r al
            c h e mi c a l s , w a s h w i t h a s o l v en t su c h a s n - h e x a n e b e f o r e u s e .
        3. Reference standard
          C yh e x a t in : T h i s p r o duc t c o n t a in s n o t l e s s th a n 9 9 % o f c y h e x a t in , a n d
            i t s me l t i n g p o i n t i s 1 9 5 - 1 9 8 ° C .
        4. Procedure
          a . E x t r a ct io n
            i . L e g u me s / p u l s e s a n d s e e d s
              We i g h 1 0 .0 g o f t he te s t s a mp l e , p r e v io u s l y g r o u n d so a s to p a s s
              t h r o u g h a st a n d a r d me s h s i e v e ( 4 2 0 µ m) . A d d 2 0 ml o f w a t e r t o t h e
              o b t ai n ed s amp l e a n d l ea v e it t o s ta n d f o r t w o h o u r s .
              T h e n , a d d 1 0 0 ml o f a c e t on e / a ce ti c a c id ( 99 :1 ) a n d h o mo g e ni z e t h e
              mi x t u r e f o r t h r e e mi n u t e s . F i l t e r th e h o mo g e n i z ed s a mp l e b y s u c t i o n
              i n t o a r o ta r y v a c u u m e v a p o r at o r th r o u g h a f il t e r p ap e r co v e r e d w i th
              a 1 - c m t h i c k l a y e r o f di a t o ma c e o u s e a r t h . C o ll e c t th e r e s i d u e o n th e
              s u r f a c e o f t h e f i lt e r p a p e r an d a d d 5 0 ml o f a c e to n e / a c e ti c aci d
              ( 9 9 : 1 ) , an d t h e n h o mo g e n iz e th e mi x t u r e f o r t h r e e mi n u t e s . R e pe a t
              t h e ab o v e p r o c e d u r e and c o mb i n e th e f i l t r a te in t o t h e r o t ar y v a c u u m



                                                             14/100
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              e v a p o r a t o r, a n d th e n co n c en t r a t e t h e mi x t u r e t o a p p r o x ima t e l y 3 0 ml
              a t 4 0 °C o r l o w e r.
              Tr a s f e r t h e c on c e nt r a te d s o l u ti o n t o a 5 0 0 - ml s e p a r a t in g f u n n el
              a l r e a d y c on t a in i ng 20 0 ml o f 1 0 % s o d iu m c h l o r id e s o l u t io n . Wa sh
              t h e eg g p l an t - s h a p ed fl a s k o f th e a b o v e r o ta r y v a c u u m e v a p o r a to r
              w i t h 1 00 ml o f n - h e x a n e a n d ad d th e w a s h i n g s t o th e s e p a r a t in g
              f u n n e l a b o v e . S h a k e th e mi x t u r e v i g o r o u s l y f o r f i v e mi n u t e s u si n g a
              s h a k e r a n d l e a v e i t t o s t a n d , a n d th e n t r an s f e r t h e n - h ex a n e la y e r t o
              a 3 0 0 - ml c o n i ca l f l a sk . A d d 5 0 ml o f n - h e x a n e t o t h e a q u eo u s l aye r
              a n d r ep e a t t h e a b o v e p r o c e d u r e , an d t h en add th e n - h e x a n e l a y e r to
              t h e c o ni c a l f l a s k a b ov e . A d d a n ad e q u a t e a mo u n t o f s o d i u m s u l f a t e
              ( a n h y d r o u s) t o t h e f l as k a n d l e av e i t t o s tan d f o r 1 5 mi n u t e s w i t h
              o c c a s io n a l s h a k i n g . F i l t e r t h e c o n te n t o f t h e f l a s k i n t o a r o t ar y
              v a c u u m e v a p o r a t o r. Was h t h e f l a s k w i t h 2 0 ml o f n - h e x a n e a n d w a s h
              t w i c e t h e r es i d u e o n t h e s u r f a c e o f t h e f i lt e r p a p e r w i t h th e w a s h i n g s .
              A d d t h e w a s h i n g s i nt o t h e r o t a r y v a c u u m e v a p o r a t o r a n d r e mo v e t h e
              n - h e x an e at 4 0 ° C o r l ow e r.
              A d d 2 0 ml o f n - h e x a n e t o t h e r e si d u e a n d t ra n s f e r t h e mi x t u r e t o a
              1 0 0 - ml s e p a r a t i n g f u n n e l , a n d t h e n ad d 4 0 ml o f n - h e x a n e - s a t u r a ted
              a c e t o n i t r i le. S h a k e t h e mi x t u r e v i g o r o u s l y f o r f i v e mi n u t e s u s i n g a
              s h a k e r an d l e a v e i t to s t a n d , a n d t h e n t r a n s fe r t h e a c eto n i t r il e l a y e r
              i n t o th e r o ta r y v a c u u m e v a p o r at o r. A d d 4 0 ml o f n - h e x an e - s a t u r a t ed
              a c e t o n i t r i le t o th e n - h e x a n e l a y er a n d r e p ea t t h e a b o v e p r o c ed u re
              t w i c e , an d t h en c o mb i n e t h e ac e t o n i t r i l e l a y e r i n to t h e r o t ar y
              v a c u u m e v a p o r a t o r a b o v e . R e mo v e t h e a c e to n it r i l e a t 4 0 °C o r l o w e r.
              D i s s o l v e t h e r e s i d u e i n n - h ex a n e t o ma k e e x a c t l y 5 ml o f s o l u ti o n .
            i i . C e r e al g r a i n s , f r u i t a n d v e g et ab l e s
              I n c a s e o f ce r e a l g r a i n s , w e i g h 1 0 . 0 g o f th e t e s t s a mp l e , p r e v i o u sly
              g r o u n d s o a s t o p a s s th r o u g h a s ta n d a r d me s h s i e v e ( 4 2 0 µ m) . A d d
              2 0 ml o f w a t e r t o th e o b t ai n ed s amp l e a n d le a v e i t t o st a n d f o r t wo
              hours.
              I n c a s e o f f r u i t a n d v e g e t ab l e s , w e i g h a c cu r a t e l y 1 k g o f t h e t e st
              s a mp l e a n d a d d a n app r o p r i a t e amo u n t o f w a t e r t o t he s a mp l e , i f
              r e q u i r e d . H o mo g e n i ze t h e mi x t u r e a n d me a s u r e o u t a s a mp l e
              e q u iv a l en t t o 2 0 . 0 g .
              T h e n , a d d 1 0 0 ml o f ac e t o n e / a ce ti c a ci d ( 9 9 :1 ) a n d h o mo g e n i z e t h e
              mi x t u r e f o r t h r e e mi n u t e s . F i l t e r th e h o mo g e n i z ed s a mp l e b y s u c t io n



                                                            15/100
Provisional Translation
from the Japanese Original


              i n t o a r o t a ry v a c u u m e v a p o r at o r th r o u g h a f il t e r p a p e r co v e r e d w i th
              a 1 - c m t h i ck l a y e r o f di a t o ma c e o u s e a r t h . Co ll e c t th e r e si d u e o n t h e
              s u r f a c e o f t h e f il t e r p a p e r a n d a d d 5 0 ml o f a ce t o n e / a c e ti c a ci d
              ( 9 9 : 1 ) , a n d t h en h o mo g e n iz e th e mi x t u r e f o r t h r e e mi n u t e s . R ep e at
              t h e a b o v e p r o c e d u r e a n d c o mb i n e th e f i l t r at e in t o t h e r o t ar y v a c u u m
              e v a p o r a t o r, a n d t h e n co n c en t r a t e t h e mi x t u r e t o a p p r o x ima t e l y 3 0 ml
              a t 4 0 °C o r l o w e r.
              Tr a n s f e r t h e c o n c en t ra t e d s o lu t io n t o a 5 0 0 - ml s e p a r a t i n g f u n n e l
              a l r e a d y c on t a in i ng 20 0 ml o f 1 0 % s o d iu m c h l o r id e s o l u t io n . Wa sh
              t h e eg g p l an t - s h a p ed fl a s k o f th e a b o v e r o ta r y v a c u u m e v a p o r a to r
              w i t h 1 00 ml o f n - h e x a n e a n d ad d th e w a s h i n g s t o th e s e p a r a t in g
              f u n n e l a b o v e . S h a k e th e mi x t u r e v i g o r o u s l y f o r f i v e mi n u t e s u si n g a
              s h a k e r a n d l e a v e i t t o s t a n d , a n d th e n t r an s f e r t h e n - h ex a n e la y e r t o
              a 3 0 0 - ml c o n i ca l f l a sk . A d d 5 0 ml o f n - h e x a n e t o t h e a q u eo u s l aye r
              a n d r e p ea t t h e a b o v e p r o c e d u r e t w i c e , an d t h e n co mb i n e t h e
              n - h e x an e l ay e r t o th e co n i ca l f l a sk a b o v e . A d d an a d eq u a t e a mo u n t
              o f s o d iu m s u l f a t e ( an h y d r o u s ) t o t h e f l a s k an d l e a v e it t o s t an d f o r
              1 5 mi n u t e s w i t h o c c a si o n al s h ak in g . F i lt e r th e co n te n t o f t h e f l a sk
              i n t o a r o t ar y v a c u u m e v a p o r a t o r. Wa s h t h e f l a s k w i th 2 0 ml o f
              n - h e x an e , an d w a s h tw i c e t h e re s i d u e o n t h e su r f a c e o f th e f i lte r
              p a p e r w i t h t h e w a s h i ng s . A d d t h e w a s h i n g s i n t o th e r o t a r y v a c u u m
              e v a p o r a t o r a n d r e mo v e th e n - h e x a n e a t 4 0 ° C o r l o w e r, a n d th e n
              d i s s o l v e t h e r e s i d u e i n n - h ex a n e t o ma k e e x a c t l y 1 0 ml o f s o l u ti o n .
            i i i . Ma t ch a a n d h o p s
              I n c a s e o f ma t c h a , w e i g h 5 . 0 0 g o f t h e t e s t s a mp l e a n d a d d 2 0 ml o f
              w a t e r, a n d t h e n l e av e i t t o s t a n d f o r t w o h o u r s .
              I n c a s e o f h o p s , w e ig h 5 .0 0 g o f t h e te s t s amp l e , p r e v io u s l y g r o un d ,
              a n d ad d 2 0 ml o f w a t e r, a n d t h en le a v e it to st a n d f o r t wo h o u r s .
              T h e n , a d d 1 0 0 ml o f ac e t o n e / a ce ti c a ci d ( 9 9 :1 ) a n d h o mo g e n i z e t h e
              mi x t u r e f o r t h r e e mi n u t e s . F i l t e r th e h o mo g e n i z ed s a mp l e b y s u c t io n
              i n t o a r o t a ry v a c u u m e v a p o r at o r th r o u g h a f il t e r p a p e r co v e r e d w i th
              a 1 - c m t h i ck l a y e r o f di a t o ma c e o u s e a r t h . Co ll e c t th e r e si d u e o n t h e
              s u r f a c e o f t h e f il t e r p a p e r a n d a d d 5 0 ml o f a ce t o n e / a c e ti c a ci d
              ( 9 9 : 1 ) , a n d t h en h o mo g e n iz e th e mi x t u r e f o r t h r e e mi n u t e s . R ep e at
              t h e a b o v e p r o c e d u r e a n d c o mb i n e th e f i l t r at e in t o t h e r o t ar y v a c u u m
              e v a p o r a t o r, a n d t h e n co n c en t r a t e t h e mi x t u r e t o a p p r o x ima t e l y 3 0 ml
              a t 4 0 °C o r l o w e r.



                                                         16/100
Provisional Translation
from the Japanese Original


              Tr a n s f e r t h e c o n c en t ra t e d s o lu t io n t o a 5 0 0 - ml s e p a r a t i n g f u n n e l
              a l r e a d y c on t a in i ng 20 0 ml o f 1 0 % s o d iu m c h l o r id e s o l u t io n . Wa sh
              t h e eg g p l an t - s h a p ed fl a s k o f th e a b o v e r o ta r y v a c u u m e v a p o r a to r
              w i t h 1 00 ml o f n - h e x a n e a n d ad d th e w a s h i n g s t o th e s e p a r a t in g
              f u n n e l a b o v e . S h a k e th e mi x t u r e v i g o r o u s l y f o r f i v e mi n u t e s u si n g a
              s h a k e r a n d l e a v e i t t o s t a n d , a n d th e n t r an s f e r t h e n - h ex a n e la y e r t o
              a 3 0 0 - ml c o n i ca l f l a sk . A d d 5 0 ml o f n - h e x a n e t o t h e a q u eo u s l aye r
              a n d r e p ea t t h e a b o v e p r o c e d u r e t w i c e , an d t h e n co mb i n e t h e
              n - h e x an e l ay e r t o th e co n i ca l f l a sk a b o v e . A d d an a d eq u a t e a mo u n t
              o f s o d iu m s u l f a t e ( an h y d r o u s ) t o t h e f l a s k an d l e a v e it t o s t an d f o r
              1 5 mi n u t e s w i t h o c c a si o n al s h ak in g . F i lt e r th e co n te n t o f t h e f l a sk
              i n t o a r o t ar y v a c u u m e v a p o r a t o r. Wa s h t h e f l a s k w i th 2 0 ml o f
              n - h e x an e an d w a s h tw i c e t h e r e s i d u e on t h e s u r f a c e o f t h e f i l te r
              p a p e r w i t h t h e w a s h i ng s . A d d t h e w a s h i n g s i n t o th e r o t a r y v a c u u m
              e v a p o r a t o r a n d co n cen t r a t e th e mi x t u r e t o a p p r o xi ma t e l y 5 ml a t
              4 0 ° C o r l ow e r, a n d th e n a d d n -h e x an e to ma k e e x a c tl y 1 0 ml o f
              s o l u t io n .
            i v. Te a s o t h e r t h a n ma t c h a
              We i g h 9 .0 0 g o f t h e te s t s a mp l e a n d s o ak i t i n 5 4 0 ml o f w a t e r a t
              1 0 0 ° C , an d t h e n l e av e i t t o s t an d a t r o o m t e mp e r a t u r e f o r f i v e
              mi n u t e s . Tr a n s f r e r 3 6 0 ml o f t h e c o o l e d f i l t r a t e i n to a 5 0 0 - ml
              s e p a r a t i ng f u n n e l an d a d d 3 0 g o f s o d i u m c h l o r i d e , 2 ml o f 2 %
              s o d i u m d o d e c y l s u l f a te s o lu t io n a n d 1 00 ml o f n -h e x an e . S h a k e t h e
              mi x t u r e v ig o r o u s l y f o r f i v e mi n u t e s u s in g a s h a k e r a n d l ea v e i t to
              s t a n d , a n d th e n t r a n s f er t h e n - h exa n e l a ye r to a 30 0 - ml c o n ic a l f l a sk .
              A d d 1 0 0 ml o f n - h e x an e t o th e aq u e ou s l a ye r a n d r e p ea t t h e ab o ve
              p r o c e d u r e tw i c e , a n d th e n c o mb i n e t h e n - h exa n e l a ye r to t h e co n ica l
              f l a s k a b ov e. A d d a n ad e q u at e a mo u n t o f s o d iu m s u l f a t e ( a n h y d ro u s)
              t o th e f l a sk a n d l ea v e i t t o s t an d f o r 1 5 mi n u te s with occasional
              s h a k i n g . F i l t e r t h e co n t en t o f t h e f l a s k i n t o a r o ta r y v a c u u m
              e v a p o r a t o r. Wa s h t h e f l a s k w i t h 2 0 ml o f n - h e x an e an d w a s h t w i ce
              t h e r e s id u e o n th e su r f a c e o f t h e f i l t e r p a p e r w i t h t h e w as h i n g s . A d d
              t h e w a s h in g s i n to th e r o t a r y v a c u u m e v a p o r a t o r a n d r e mo v e
              n - h e x an e a t 4 0 ° C o r l ow e r. D i s s o l v e t h e r e s idu e i n n - h e x a n e t o ma k e
              e x a c tl y 6 ml o f s o l u t i o n .
            v. F o o d s o th e r t h an t h o s e l i s t ed in i to i v a b o v e
              O b t a i n t h e e x t r a c t s a cc o r d i n g t o t he me t h o ds d e s c r i be d i n i , ii , o r



                                                         17/100
Provisional Translation
from the Japanese Original


              iii.
          b . E t h y l at io n
            Tr a n s f e r 1 ml ( 2 ml f o r c e r e a l g r a i n s , t e a s an d h o p s ) o f t h e s o lu t io n
            o b t ai n ed b y t h e ex t r a c ti o n d e s c r i be d in 4 - a to a 5 0 - ml t e s t t ub e w i t h a
            g l a s s s t o p p e r a n d ad d 1 ml ( 2 ml f o r c e r e a l g r a i n s , t e a s a n d h o p s ) o f a
            3 mo l / l et h y l ma g n e s i u m b r o mi d e - e t h e r e a l s o l u t io n , a n d t h en l ea v e i t
            t o s t an d f o r 2 0 mi n u t e s a t r o o m t e mp e r a t u r e .
            T h e n , a d d 1 0 ml o f 0 . 5 ml / l s u l f u r i c a ci d g r a d u a l l y an d a d d 1 0 ml o f
            w a t e r t o b e mi x e d . A d d 1 0 ml o f n - h e x an e to t h e mi x t u r e a n d s h a k e
            t h e mi x t u r e v i go r o u s ly f o r o n e mi n u t e , a n d t h en l e av e i t to s ta n d .
            Tr a n s f e r t h e n - h e x a n e l a ye r t o a 5 0 - ml c o ni c a l f l a s k. A d d 5 ml o f
            n - h e x an e to t h e a qu eo u s l a y e r a n d r e p e a t th e a b o v e p r o c e d u r e , an d
            t h e n c o mb i n e th e n - h ex a n e l a y e r t o th e c o n ic a l f l a s k ab o v e. A d d a n
            a d e qu a t e amo u n t o f s o d i u m s u l f a t e ( a n h y d ro u s ) t o th e f l a s k a n d l ea v e
            i t to s t an d f o r 1 5 mi n u t e s w i th o c c a s i o n a l s h a k in g . F i lt e r t h e co n te n t
            o f t h e f l a sk i n t o a r o tar y v a c u u m e v a p o r a t o r. Wa s h t h e fl a s k w i t h 5 m l
            of n-hexane and wash the residue on the surface of the filter paper
            w i t h t h e w a s h i n g s . A d d t h e w a s h in g s t o t h e ro t a r y v a c u u m e v a p o r a to r
            a n d co n ce nt r a t e t he mi x t u r e to 2 ml a t 4 0 ° C o r l o w e r.
          c . C l e an - u p
            A d d 5 g o f f l o r i s i l f o r c o l u mn c h r o ma t o g r a p h y s u s p e n d ed i n n - h ex an e
            i n t o a c h ro ma t o g r a p h t u b e ( 1 5 m m i n i n n e r d i a me t e r, 3 0 0 m m i n
            l e n gt h ) a nd a d d ov e r ap p r o x i ma t e l y 5 g o f s o d i u m s u l f a t e ( a n h y d r o u s )
            i n t o th e c o l u mn . S p i l l o u t t h e n -h e x an e u n ti l o n l y a s ma l l a mo u n t
            r e ma i n s o n t h e p a ck i ng o f t h e co l u mn a n d p o u r t h e s o l u tio n o b t ai n ed
            b y t h e e t h yl a t i o n d e s cr i b e d i n 4 - b i n to t h e c o l u mn . T h e n , w a s h th e
            e g g p l a n t - s h a p e d f l a s k o f t h e r o t a ry v a c u u m e v a p o r at o r w i t h 15 ml o f
            n - h e x an e an d t r a n s f e r r h e w a s h in g s to t h e c o l u mn , a n d th e n c o l le c t
            t h e e lu a t e i n t o th e r o t a r y v a c u u m e v a p o r a t o r. T h e n , p o u r 5 0 ml o f
            e t h e r / n - h e x a n e ( 1 :9 9 ) i n t o t h e col u mn a n d co l l e ct t h e e l u a te i n th e
            r o t a r y v a c uu m e v a p o r at o r, a nd t h en r e mo v e t h e e th e r a nd n - h e x a n e a t
            4 0 ° C o r l o w e r. D i s s o l v e th e r e s id u e in n - h e x a n e t o ma k e e x ac t l y 2 m l
            o f s o l u ti o n , w h i c h i s u s e d a s t h e sa mp l e s o l u ti o n .
        5 . D e t e r mi n a t io n
          a . Q u a l i ta t iv e t e s t s
            P e r f o r m q u a l i t at i v e t es t s u n d e r th e f o l l o w in g c o n d i t io n s . Te s t r e s u l t s
            o b t ai n ed mu s t b e t h e s a me a s t h o s e o b t a i n ed f o r t h e c y h ex a t in



                                                           18/100
Provisional Translation
from the Japanese Original


            r e f e r e n c e s t a n da r d u nd e r t h e p r o c e d u r e d e s cr i b e d in 4 -b . A z o c y c lo tin
            i s mo d i f i e d b y e t h yl a t io n in t o t h e s a me s u b s t a n c e a s c y h e x a t in .
            Te s t i n g c o n d i t io n s
            C o l u mn : A s i l i c a te g l as s c a p i l l a r y c o l u mn ( 0 . 3 2 mm- 0 . 5 3 mm i n i n n e r
               d i a me t e r, 3 0 m i n l en g t h ) c o at e d w i t h 5 % p h e n y l me t h y l s i l i co n e f o r
               g a s c h r o ma t o g r a p h y t o a t h ic k n e s s o f 1 . 5 µ m.
            C o l u mn t emp e r a t u r e : H o l d th e co l u mn t e mp e r a t u r e a t 1 2 0 ° C f o r t w o
               mi n u t e s , f o l l o w e d b y a n in c r ea s e o f 1 0 ° C e v e r y mi n u t e u n ti l
               r e a c h i n g 2 0 0 ° C , a f t e r w h i c h in c r ea s e t h e t e mp e r a t u r e b y 2 0 ° C e v e ry
               mi n u t e u nt il r e a c h in g 3 0 0 ° C , a n d h o ld f o r f i v e mi n u t e s .
            I n l e t t e mp e r a t u r e : 2 8 0 ° C
            D e t e c t o r : Op e r a t e at 3 0 0 ° C .
            G a s f l o w r a t e : U s e h el i u m a s t h e c a r r i e r g a s . A d j u s t th e f l o w r a t e s o
               t h a t c yh e x at i n f lo w s o u t in ap p r o x i ma t e l y 1 3 - 1 5 mi n u t e s . A d j u s t th e
               f l o w r a t e s o f a i r a n d h y d r o g e n to o p t i ma l c o n d i ti o n s .
          b . Q u a n ti t at i v e t e s t s
            D e t e r mi n e t h e q u an t i ty f r o m t h e t e s t r e s u lt s o b ta i n e d u n d e r th e s ame
            c o n d i t io n s d e s c r i b ed in 5 - a u si n g e i t he r t h e p e a k h e ig h t o r p e ak a re a
            me t h o d .
          c . C o n f i r ma t i o n t e s t s
            P e r f o r m g a s c h r o ma t o g r a p h y / ma s s s p e c t ro me t r y u n d e r t h e s am e
            c o n d i t io n s d e s c r i b ed in 5 - a . Te s t r e s u l t s o b t a i n ed f o r t h e r e f e r e n c e
            s t a n d a r d mu s t b e s a me a s t h o s e o b ta i n e d u n d e r t h e p r o c e d u r e
            d e s c r i b ed in 4 - b . D e t er mi n e t h e q u a n ti t y u s in g e i th e r th e p ea k h ei g h t
            o r p e a k a r ea me t h o d , if r e q u i r e d .

      ( 5 ) A mi t r o l e a n a l y t ic a l me t h o d
        1. Apparatus
          A h i g h - p e r fo r ma n c e l iq u i d ch r o ma t o g r ap h wi t h a f l u o r es c e n c e d e tec t o r
          ( H P L C - F L ) a n d a l iq u i d ch r o ma t o g ra p h / ma s s s p e c t r o m e t e r ( L C / M S o r
          LC/MS/MS).
        2 . R e ag e n t s a n d t e s t s o l u t io n s
          I n a d d i t io n t o t h e r e ag e n t s a n d te s t s o lu t i o n s l i s t ed b e l o w, u s e th o s e
          l i s t e d in S e c t i o n C R e a g e n ts /Te s t S o l u ti o n s , E t c . , P a r t I I F o o d
          a d d it i v e s .
          A c e t o n e: Us e a r o ta r y v a cu u m e v a p o r at o r o n 3 0 0 mL o f a ce t o n e t o
            c o n c en t r a t e t o t h e p o in t o f d r y n e s s . D i s s o l v e t h e r e s i d u e i n 5 mL o f
            n - h e x an e . F o r a n a l y s i s , i n j ec t 5 μ L o f th e so l u ti o n i n to a GC -ECD.



                                                            19/100
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            P e a k s o t h er t h a n t h a t o f n - h e x an e i n th e r e s u l t i n g ch r o ma t o g r a m
            s h o u ld b e as h i g h a s o r l o w e r t h an t h e p e a k s o f γ - B H C a t 2 x 1 0 - 1 1 g .
          E t h a n o l : Us e a r o t a r y v a c uu m e v a p o r at o r o n 30 0 mL o f e t ha n ol t o
            c o n c en t r a t e t o t h e p o in t o f d r y n es s . D i s s o l v e t h e r e s i d u e i n 5 mL o f
            n - h e x an e . F o r a n a l y s i s , i n j e ct 5 μ L o f th e s o l u t i o n i n to a g a s
            c h r o ma t o g r a p h e qu i ppe d w i t h a n e l e c t r o n c a p tu r e d e te c t o r. P e a k s
            o t h e r t h a n t h a t o f n - h e x a n e i n the r e s u l t i ng c h r o ma t o g r a m s h o u l d b e
            a s h i g h a s o r l o w e r t h a n t h e p ea k s o f γ - B H C a t 2 x 10 - 1 1 g .
          D i a t o ma c e o u s e a r t h : D i a t o ma c e o u s e a r t h f o r c h e mi c a l a n a l y s i s .
          A c e t i c a ci d b u ff e r s o lu t i o n : A d d 0 . 0 5 mo l / l s o d i u m a c e t a t e s o l u ti o n t o
            8 0 0 ml o f 0 . 0 5 mo l / l a c e t i c a ci d so l u ti o n to ma k e a 1 , 0 0 0 - ml s o l u t i o n .
          We a k l y a c id i c c at i o n e x c h an g e r e s i n : Wa s h t h e w e a k ly a c i d i c cat i o n
            e x c h an g e re s i n p r o d u c e d f o r c o lu mn c h o r o ma t o g r a p h y w i t h 1 mo l / l
            h y d r o c h l o r ic a c i d , s ec o n dl y w i t h a 2 . 8 % a q u eo u s am mo n i a , a n d
            t h i r d l y w i th 1 mo l / l h y d r o c h l o r ic a c i d ag a in . T h e r e a f te r, w a s h t h e
            w a s h i n g s w i t h w a t e r u n t i l t h e y b ec o me n e u t ra l .
          F l u o r e s c a mi n : A r e a g en t w i t h a p u r i t y o f 9 8 % o r h i g h e r.
          Wa t e r : D i s ti l l e d w a t e r. I f t h e d i s ti l l e d w a t e r i s f o u n d to i n c l u d e an y
            s u b s t a n ce th a t ma y i n t e r f e r e w i t h a n a l y s i s o f t h e t a rg et co mp o s i t i o n a l
            s u b s t a n ce s f r o m a g r i c u l t u r a l ch emi c a l s , w a s h w i t h a s o l v en t s u c h a s
            n-hexane before use.
          P h o s p h a te b u ff e r s o l uti o n : A d d 1 0 % p h o s p h o r i c a ci d so l u t i o n t o a 0 .0 5
            ml / l mo n o s o d i u m p h o s p h a te s o lu ti o n to ad j us t t h e p H to 3 . 0.
        3. Reference standard
          A mi t r o l e : T h i s p r o duc t c o n t a in s n o t le s s t h an 9 8 % o f ami t r o l e , a n d i t s
            me l t i n g po in t i s 15 7 - 15 9 ° C .
        4. Procedure
          a . E x t r a ct io n
            i . C e r e a l g r a i n s , l eg u me s / p u l s e s , se e d s , f r u i t , v e g et a b le s , ma t c h a a n d
              hops
              I n c a s e o f c e r e a l g r ain s , l eg u me s /p u l s e s an d s e e d s , w e i g h 3 0 .0 g o f
              t h e t e s t s amp l e , p r e v io u s l y g r o u n d s o a s t o p a s s th r o u g h a s t an d ar d
              me s h s i e v e ( 4 2 0 µ m) .
              I n c a s e o f f r u i t a n d v e g e t ab l e s , w e i g h a c c u r a t e l y a b o u t 1 k g . o f th e
              t e s t s a mp l e a n d ad d a n a p p r o p r i a te a mo u n t o f w a t e r t o th e s a mp l e , i f
              r e q u i r e d . H o mo g e n i ze t h e mi x t u r e a n d me a s u r e o u t a s a mp l e
              e q u iv a l en t t o 3 0 . 0 g .



                                                           20/100
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from the Japanese Original


              I n c a s e o f ma t c h a , w e i g h 3 0 .0 g o f t h e te s t s a mp l e .
              I n c a s e o f h o p s , w e ig h 3 0. 0 g o f t h e te s t s amp l e , p r e v io u s l y g r o un d .
              T h e n , ad d 8 0 ml o f e t h a n o l a n d h o mo g e n i z e t h e mi x t u r e f o r t h r e e
              mi n u t e s . F i l t e r th e h o mo g e n i z ed s a mp l e b y s u c t i o n in t o a r o t a ry
              v a c u u m e v a p o r a t o r t h ro u g h a f i l t er p a p e r c o v e r e d w i t h a 1 - c m t h i c k
              l a y e r o f d i a t o ma c e o u s e a r t h , a n d t h en t r an s f e r t h e f i l t r a t e to a
              2 0 0 - ml g r a d u a te d c yl in d e r. C o l lec t t h e r e s i d u e o n th e su r f a c e o f t h e
              f i l t e r p a p e r a n d ad d 4 0 ml o f 6 0 % e t h an o l , a n d t h en h o mo g e n i z e th e
              mi x t u r e f o r t h r e e mi n u t e s . R e p e at t h e a b o v e p r o c e d u r e a n d c o mb i n e
              t h e f i l t r a t e t o t h e g r ad u a te d c y l in d e r a b o v e, a n d t h e n me a s u r e t h e
              a mo u n t o f f i l t r a t e .
              Tr a n s f e r 1 0 ml o f t h e a b o v e f i l t ra t e t o a 2 0 0 - ml r o u n d b o t to m f l a s k
              a n d ad d 1 ml o f h y d r o g e n p e ro x i de s o lut i o n . A t t a ch a r e f l u x
              c o n d e n s e r to t h e f la s k a n d h e a t t h e mi x t u r e f o r 3 0 mi n u t e s i n a w a t er
              b a t h a t 7 5 °C , a n d t h e n a l l o w it t o c o o l.
            i i . Tea s e x ce p t ma t c h a
              We i g h 10 . 0 g o f t e s t s amp l e a n d so a k it i n 6 0 0 ml o f w a t e r a t 1 0 0 ° C,
              a n d t h en le a v e i t t o s t a n d a t r o o m t e mp e r a t u r e f o r fi v e mi n u t es .
              Tr a n s f e r 1 2 ml o f t h e c o o l ed f il t r a t e i n to a 2 0 0 - ml r o u n d b o tt o m
              f l a s k a n d ad d 1 ml o f h yd r o g e n p e r o x id e so l u ti o n. A t t a c h a r e f lux
              c o n d e n s e r to t h e f la s k a n d h e a t t h e mi x t u r e f o r 3 0 mi n u t e s i n a w a t er
              b a t h a t 7 5 °C , a n d t h e n a l l o w it t o c o o l.
            i i i . F o o d s ex c e p t t h o s e l i s t e d i n i a n d ii a b o v e
              O b t a i n t h e e x t r a c t s acc o r d i n g to t h e me t h o d s d e s c r i b e d i n i .
          b . C l ea n - u p
            A d d 1 ml o f s t r o n g l y ac i d i c c at i o n e x ch a n g e re s i n ( 0 .0 6 3 - 0 . 1 5 6 µ m i n
            p a r t i c le s i ze ) s u s p e n d e d i n w a t e r i n t o a ch r o ma t o g r a p h t u b e ( 1 0 m m
            i n i n ne r d i ame t e r, 3 0 0 m m i n l e n g t h ) a n d d i sc a r d t h e w at e r u n t i l o n l y
            a s ma l l a mo u n t r e ma i n s o n th e p a c k in g o f th e c o l u mn . P o u r 5 ml o f
            w a t e r i n to th e co l u mn a n d d i s c a r d t h e e ff l u en t . P o u r t h e s o l u t io n i n to
            t h e c ol u mn o b t ai n ed by t h e e x t r ac t i o n d e s c ri b e d i n 4 - a. T h e n , w as h
            t h e ab ov e r o u n d b ot to m f l a s k w i t h 1 0 ml o f w a t e r an d t r an s f e r t h e
            w a s h i n g s in t o th e co lu mn , a n d th e n d i s c a r d t h e e ff l u en t . P o u r 1 2 ml
            o f 2 . 8 % a q u e o u s a mm o n i a i n t o th e c o lu mn a n d co l l ec t th e e lu a te in a
            r o t a r y v a c u u m e v a p o r a t o r. A d d 3 0 ml o f n - p r o p a n o l a n d r e mo v e t h e
            w a t e r a n d n - p r o p a n o l a t 4 5 ° C o r l o w e r. D i s s o l v e t h e r es i d u e i n 5 m l
            o f w a t e r.



                                                          21/100
Provisional Translation
from the Japanese Original


            A d d 5 ml o f w e a k l y a c i d ic c a t io n e x ch a n g e r e s i n ( 0 . 3 3 - 0 . 5 0 µm i n
            p a r t i c le s i ze ) s u s p e n d e d i n w a t e r i n t o a ch r o ma t o g r a p h t u b e ( 1 0 m m
            i n i n ne r d i ame t e r, 3 0 0 m m i n l e n g t h ) a n d d i sc a r d t h e w at e r u n t i l o n l y
            a s ma l l a mo u n t r e ma i n s o n t h e p a c k in g o f th e c o l u mn . P o u r 1 0 ml o f
            w a t e r i n t o t h e c ol umn a n d d is c a r d t h e e ff l u e n t . Po u r t h e ab o v e
            s o l u t io n in to th e c o lu mn an d d i s car d t h e e ff l u e n t . P o u r 5 0 ml o f w a t e r
            i n t o t he co lu mn a n d d is c a r d t h e e ff l u e n t . P o u r 3 5 ml o f 2 . 8 % a q u e o u s
            a mmo n i a i n t o t h e c o lu mn a n d c o l l e ct t h e e l u a te i n a r o t a r y v a c u u m
            e v a po r a t o r. A d d 1 00 ml o f n -p r o p a n o l an d r e mo v e t h e aq u eo u s
            a mmo n i a a n d n - p r o p an o l at 4 5 ° C o r l o w e r.
          c . D e r i v a t iz a t i o n
            A d d 2 ml o f a c e t i c ac id b u ff e r s ol u t io n to t he r e s i d u e to d i s s o lv e i t
            w e l l . A d d 1 0 0 µ l o f 0 . 2 5 % f l uo r e s c a mi n - a c e t o ne s o l u ti o n to 1 ml o f
            t h e ab o v e s o l u t io n a n d s h a k e the mi x tu r e w e l l , a n d th e n l e a v e it t o
            s t a n d f o r o n e h o u r. A d d 0 .5 ml o f 0 . 0 5 mo l / l s o d i u m b o r a t e s o l u t i o n
            t o u s e a s t h e s a mp l e s o l u t io n .
        5 . D e t e r mi n a t io n
          a . Q u a l i ta t iv e t e s t s
            P e r f o r m q u a l i t at i v e t es t s u n d e r th e f o l l o w in g c o n d i t io n s . Te s t r e s u l t s
            o b t ai n ed mu s t b e t h e s a me a s t h o s e o b t a i n ed f o r t h e r e f e r e n c e
            s t a n d a r d u n d e r t h e p r o c e d u r e d e s cr i b e d in 4 -c .
            Te s t i n g c o n d i t io n s
            C o l u mn p a c k i ng : O c t ad e c y l s i l a n e- b o n d ed s i li c a g e l ( 5 µm i n p a r t i cl e
              size).
            C o l u mn : A s t a i n l e s s t u b e ( 4 .6 m m i n i n n e r d i a me t e r, 1 5 0 mm i n
              length).
            C o l u mn t e mp e r a t u r e : 4 0 ° C
            D e t e c t o r : O p e r a t e w i t h a n ex c i ta t i o n w a v el e n g t h o f 3 8 0 n m a n d a
              f l u o r e s c e n t w a v e l e n g th o f 4 8 4 n m.
            M o b il e p ha s e : U s e a c e t o n i t r i le/ p h o sp h at e b u ff e r so l u ti o n ( 3 :7 ) .
              A d j u s t th e f l o w r a t e so th a t a mi t r o l e f l o w s o u t i n a pp r o x i ma t e l y 1 5
              mi n u t e s .
          b . Q u a n ti t at i v e t e s t s
            D e t e r mi n e t h e q u an t i ty f r o m t h e t e s t r e s u lt s o b ta i n e d u n d e r th e s ame
            c o n d i t io n s d e s c r i b ed in 5 - a u si n g e i t he r t h e p e a k h e ig h t o r p e ak a re a
            me t h o d .
          c . C o n f i r ma t i o n t e s t s



                                                           22/100
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            P e r f o r m l i q u i d c h r o ma t o g r a p h y/ ma s s s p e c t r o me t r y u n d e r t h e sa me
            c o n d i t io n s d e s c r i b ed in 5 - a . Te s t r e s u l t s o b t a i n ed f o r t h e r e f e r e n c e
            s t a n d a r d mu s t b e th e s a me a s t h o s e o b t a in e d u n d e r t h e p r o c e d u r e
            d e s c r i b ed in 4 - c . D e t er mi n e t h e qu a n ti t y u s in g e i th e r the p ea k h ei gh t
            o r p e a k a r ea me t h o d , if r e q u i r e d .

      ( 6 ) C a p t a f ol a n al yt i c a l me t h o d
        1. Apparatus
          A g a s c h r oma t o g r a p h w i t h an e lec t r o n c a p tu r e d e t ec t o r ( G C - E C D ) a n d
          a g a s ch r oma t o g r a p h /ma s s s p e c t r o me t e r ( G C / M S o r G C / M S / M S ) .
        2 . R e ag e n t s a n d t e s t s o l u t io n s
          I n a d d i t io n t o t h e r e ag e n t s a n d te s t s o lu t i o n s l i s t ed b e l o w, u s e th o s e
          l i s t e d in S e c t i o n C R e a g e n ts /Te s t S o l u ti o n s , E t c . , P a r t I I F o o d
          a d d it i v e s . R e a g en t s d e s i g n at e d as “s p e c i a l g r a d e ” i n th i s s e c ti o n mu s t
          me e t t h e re q u i r e me n t s f o r “s p e c i a l g r a d e” s p e c i f ie d i n t h e J ap a n
          I n d u s t r i a l St a n d a r d s fo r t h e r e ag e n t s .
          A c e t o n it r i le : U s e a r o t a r y v a c u u m e v a p o r a t o r o n 3 0 0 mL o f a c e t o n i t ri l e
            t o c o n c e n t r a t e t o t h e p o i n t o f d r y n e s s . D i s s o l v e t h e r e s id u e i n 5 mL o f
            n - h e x an e . F o r a n a l y s i s , i n j ec t 5 μ L o f th e so l u ti o n i n to a GC -ECD.
            P e a k s o t h er t h a n t h a t o f n - h e x an e i n th e r e s u l t i n g ch r o ma t o g r a m
            s h o u ld b e as h i g h a s o r l o w e r t h an t h e p e a k s o f γ - B H C a t 2 x 1 0 - 1 1 g .
          A c e t o n e: U s e a r o t a r y v a c u u m e v ap o r at o r o n 3 0 0 mL o f a c e to n e t o
            c o n c en t r a t e t o t h e p o in t o f d r y n es s . D i s s o l v e t h e r e s i d u e i n 5 mL o f
            n - h e x an e . F o r a n a l y s is , i n j ec t 5 μ L o f t h e s o l u ti o n i n to a G C - E CD .
            P e a k s o t h er t h a n th a t o f n - h e x an e i n t h e r e s u l t i n g ch r o ma t o g r a m
            s h o u ld b e as h i g h a s o r l o w e r t h an t h e p e a k s o f γ - B H C a t 2 x 1 0 - 1 1 g .
          S o d i u m c h l o r i d e : S o diu m c h l o r i d e ( s p e c i a l g r a d e ) . I f t h e r e a g en t i s
            f o u n d to i nc l u de a n y s u b s t a n c e t h a t ma y i n t er f e r e w i t h t h e a n al y s i s o f
            s u b s t a n ce s t o b e a n al y z e d f r o m a g r i c u l tu r a l c h e mi c a l s , w a s h w i t h a
            s o l v e n t s u ch a s n - h e x a n e b e f o r e u s e .
          S y n t h e t i c ma g n e s i u m s i l i c at e (F l o r i s i l ) f o r c o l u mn c h r o ma t o g r a p h y:
            H e a t f l o r i s il ( 1 5 0 -2 5 0 μ m i n p a r t ic l e s i ze ) a t 1 3 0 ° C f o r 1 2 h o u r s o r
            l o n g e r. C o o l d o w n t o ro o m t e mp e r a t u r e in a d e s i c c a to r.
          D i a t o ma c e o u s e a r t h : D i a t o ma c e o u s e a r t h f o r c h e mi c a l a n a l y s i s .
          E t h y l a c et at e : U s e a ro t a r y v a c u u m e v a p o ra t o r o n 3 0 0 mL o f e th y l
            a c e t a te t o co n c en t r a t e t o t h e p o i n t o f d r y n e s s . D i s s o l v e th e r e s i d u e in
            5 mL o f n - h e x an e . F o r a n a l y s i s , i n j e c t 5 μL o f t h e s o l u t i o n i n t o a
            GC-ECD.            P e a k s o t h e r t h a n th a t o f n - h e x an e i n t h e r e s u lt i n g


                                                            23/100
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            c h r o ma t o g r a m s h o u l d b e a s h ig h a s o r lo w e r t h an t h e pe a k s o f γ - B H C
            a t 2 x 10 - 1 1 g .
          n - H e x a n e : U s e a r o t a r y v a c u u m e v a p o r at o r on 3 00 mL o f n - h e x a n e t o
            e v a p o r a t e u n t i l 5 mL i s l e f t . F o r a n a l y s i s , i n j e c t 5 μ L o f t h e s o lu t io n
            i n t o a G C - E C D . P e a k s o t h e r th an t h at o f n- h e x a n e i n t h e r e s u l t in g
            c h r o ma t o g r a m s h o u l d b e a s h ig h a s o r lo w e r t h an t h e pe a k s o f γ - B H C
            a t 2 x 10 - 1 1 g .
          Wa t e r : D i s ti l l e d w a t e r. I f t h e d i s ti l l e d w a t e r i s f o u n d to i n c l u d e an y
            s u b s t a n ce th a t ma y i n t e r f e r e w i t h a n a l y s i s o f t h e t a rg et co mp o s i t i o n a l
            s u b s t a n ce s f r o m a g r i c u l t u r a l ch emi c a l s , w a s h w i t h a s o l v en t s u c h a s
            n-hexane before use.
          S o d i u m s u l f a t e ( a n h y d r o u s ) : S o d iu m s u l f a t e ( a n h y d r o u s) ( s p e c i a l g ra d e ) .
            I f t h e r e a g e n t i s f o u n d t o in c lu d e a n y s u b st a n c e t h at ma y i n t e r f e r e
            w i t h a n al y s i s o f t h e t a rg e t co mp o s i t i o n a l s u b st a n c e s f r o m a g r i c u l t u r al
            c h e mi c a l s , w a s h w i t h a s o l v en t su c h a s n - h e x a n e b e f o r e u s e .
        3. Reference standard
          C a p t a f o l : Th i s p r o d u c t c o n ta i n s no t l e s s th a n 9 8 % o f c ap t a f o l , a n d i t s
            me l t i n g po in t i s 15 9 - 16 1 ° C .
        4. Procedure
          a . E x t r a ct io n
            i . C e r e a l g r a i n s , l eg u me s / p u l s e s an d s e ed s
              We i g h 1 0. 0 g o f th e te s t s a mp l e , p r e v io u s l y g r o u n d s o a s to p a s s
              t h r o u g h a s t a n d a r d me s h s i e v e ( 4 2 0 µm) . A d d 2 0 ml o f 3 %
              p h o s ph o r i c a c i d s o lu t io n t o t h e o b ta i n ed s a mp l e a n d l e a v e i t t o s t an d
              for two hours.
              T h e n , a d d 1 0 0 ml a c e t o n e an d h o mo g e n i z e t h e mi x t u r e f o r t h r ee
              mi n u t e s F i l t e r t h e h o mo g e n i z e d s a mp l e b y s u c t i o n in t o a r o t a ry
              v a c u u m e v ap o r a t o r t h ro u g h a f i l t er p a p e r c o v e r e d w i t h a 1 - c m t h i c k
              l a y e r o f d ia t o ma c e o u s e a r t h . Co ll e c t t h e r e si d u e o n th e s u r f a c e o f
              t h e f il t e r p a p e r an d a d d 5 0 ml o f a c e t o n e , a n d th e n h o mo g e n i z e t h e
              mi x t u r e f o r t h r e e mi n u t e s . R ep e a t t h e a b o v e p r o c e d u r e an d co mb i n e
              t h e f i l t r at e i n t o t h e r o ta r y v a c u u m e v a p o r a t o r, a n d t h en c o n c en t r a t e
              t h e mi x t u r e t o ap p r o xima t e l y 3 0 ml a t 4 0 ° C o r l o w e r.
              Tr a n s f e r t h e c o n c en t ra t e d s o lu t io n t o a 3 0 0 - ml s e p a r a t i n g f u n n e l
              a l r e a d y c on t a in i ng 10 0 ml o f 1 0 % s o d iu m c h l o r id e s o l u t io n . Wa sh
              t h e eg g p l an t - s h a p ed fl a s k o f t h e a b o v e r o ta r y v a c u u m e v a p o r a to r
              w i t h 1 00 ml o f n - h e x a n e ,a n d ad d t h e w a s h i n g s to t h e s e p a r a t ing



                                                             24/100
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              f u n n e l a b o v e . S h a k e th e mi x t u r e v i g o r o u s l y f o r f i v e mi n u t e s u s i n g a
              s h a k e r an d l e a v e i t t o s t a n d , a n d th e n t r a n s f e r t h e n - h e x a n e l a y e r t o
              a 3 0 0 - ml c o n i ca l f l a sk . A d d 50 ml o f n - h e x a n e t o t h e a q u eo u s l aye r
              a n d r e p ea t t h e a b o v e p r o c e d u r e , a n d ad d th e n - h e x an e l a y e r t o t h e
              c o n ic a l f l as k a b o v e . A d d a n ad e q u at e a mo u n t o f s o d i u m s u l f a t e
              ( a n h y d r o u s) t o t h e f l as k a n d l e av e i t t o s t an d f o r 1 5 mi n u t e s w i t h
              o c c a s io n a l s h a k i n g . F i l t e r t h e c o n te n t o f t h e f l a s k i n t o a r o t ar y
              v a c u u m e v a p o r a t o r. Was h t h e f l a s k w i t h 2 0 ml o f n - h e x a n e a n d w a s h
              t w i c e t h e r es i d u e o n t h e s u r f a c e o f t h e f il t e r p a p e r w i t h th e w a s h i n g s .
              A d d t h e w as h i n g s in t o t h e r o t a r y v a c u u m e v a p o r a t o r a n d r e mo v e t h e
              n - h e x an e at 4 0 ° C o r l ow e r.
              A d d 3 0 ml o f n - h e x a n e t o t h e r e si d u e a n d t ra n s f e r t h e mi x t u r e t o a
              1 0 0 - ml s e p a r a t i n g f u n n e l , a n d t h e n a d d 3 0 ml o f n - h e x a n e - s a t u r a te d
              a c e t o n i t r i l. S h a k e t h e mi x t u r e v ig o ro u s l y f o r f i v e mi n u t e s u s i n g a
              s h a k e r an d l e a v e it to s t a n d , a n d t h e n t r a n s fe r t h e a ce to n i t r il e l a y e r
              i n t o th e r o ta r y v a c u u m e v a p o r a t o r. A d d 3 0 ml o f n - h e x an e - s a t u r a t ed
              a c e t o n i t r i le t o t h e n - h e x a n e l a y er a n d r e p ea t t h e ab o v e p r o c ed u re
              t w i c e , an d t h en co mb i n e t h e ac e t o n i t r i l e l a y e r i n to t h e r o t ar y
              v a c u u m e v a p o r a t o r ab o v e . R e mo v e t h e a ce t o n i t r i l e a t 4 0 ° C o r l o w e r
              a n d d i s s o l ve t h e r e s idu e i n 5 ml o f n - h e x an e .
            i i . F r u i t , v eg e t ab l e s , ma t c h a a n d h o p s
              I n c a s e o f f r u i t a n d v e g e t ab l e s , w e i g h a c cu r a t e l y 1 k g o f t h e t e st
              s a mp l e    and      add       500      ml     of     10%       phosphoric            ac i d    s o l u tio n .
              H o mo g e n i ze t h e mi x t u r e a n d me s u r e o u t a s a m p l e e q u iv a l e n t t o 2 0 . 0 g .
              I n c a s e o f ma t c h a , w e i g h 5 .0 0 g o f t h e t e t sa mp l e a n d a d d 2 0 ml o f
              3 % ph o s pho r i c ac i d so l u ti o n , and th e n l e av e it to sta n d fo r t w o
              hours.
              I n c a s e o f h o p s , w e ig h 5 .0 0 g o f t h e te s t s amp l e , p r e v io u s l y g r o un d ,
              a n d a d d 2 0 ml o f 3 % p h o s p h o r i c a c id s o l u tio n , a n d th en l ea v e i t to
              s t a n d f o r tw o h o u r s .
              T h e n , a d d 1 0 0 ml o f a c e t on e and h o mo g e n iz e t he mi x t u r e f o r t h re e
              mi n u t e s . F i l t e r th e h o mo g e n i z ed s a mp l e b y s u c t i o n in t o a r o t a ry
              v a c u u m e v a p o r a to r t h r o u g h a f i l te r p a p e r co v e r e d w i t h a 1 - c m thick
              l a y e r o f d ia t o ma c e o u s e a r t h . Co ll e c t th e r e si d u e o n t h e s u r f a c e o f
              t h e f i l t e r p a p e r a n d a d d 5 0 ml o f a c e t o n e , a n d t h e n h o mo g e n i z e t h e
              mi x t u r e f o r t h r e e mi n u t e s . R p e at t h e ab o v e p r o c e d u r e a n d co mb i n e
              t h e f i lt r a t e i n t o t h e r o ta r y v a c u u m e v a p o r a t o r, a n d t h e n c o n c en t r a t e



                                                          25/100
Provisional Translation
from the Japanese Original


              t h e mi x t u r e t o ap p r o xima t e l y 3 0 ml a t 4 0 ° C o r l o w e r.
              Tr a n s f e r t h e c o n c en t ra t e d s o lu t io n t o a 3 0 0 - ml s e p a r a t i n g f u n n e l
              a l r e a d y c on t a in i ng 10 0 ml o f 1 0 % s o d iu m c h l o r id e s o l u t io n . Wa sh
              t h e eg g p l an t - s h a p ed fl a s k o f th e a b o v e r o ta r y v a c u u m e v a p o r a to r
              w i t h 1 00 ml o f n - h e x a n e a n d ad d th e w a s h i n g s t o th e s e p a r a t in g
              f u n n e l a b o v e . S h a k e th e mi x t u r e v i g o r o u s l y f o r f i v e mi n u t e s u si n g a
              s h a k e r a n d l e a v e i t t o s t a n d , a n d th e n t r an s f e r t h e n - h ex a n e la y e r t o
              a 3 0 0 - ml c o n i ca l f l a sk . A d d 5 0 ml o f n - h e x a n e t o t h e a q u eo u s l aye r
              a n d r e p ea t t h e a b o v e p r o c e d u r e t w i c e , an d t h e n co mb i n e t h e
              n - h e x an e l ay e r t o th e co n i ca l f l a sk a b o v e . A d d an a d eq u a t e a mo u n t
              o f s o d iu m s u l f a t e ( an h y d r o u s ) t o t h e f l a s k an d l e a v e it t o s t an d f o r
              1 5 mi n u t e s w i t h o c c a si o n al s h ak in g . F i lt e r th e co n te n t o f t h e f l a sk
              i n t o a r o t ar y v a c u u m e v a p o r a t o r. Wa s h t h e f l a s k w i th 2 0 ml o f
              n - h e x an e an d w a s h tw i c e t h e r e s i d u e on t h e s u r f a c e o f t h e f i l te r
              p a p e r. A d d t h e w a s h in g s i n t o th e r o t a r y v a c u u m e v a p o r a to r a n d
              r e mo v e t h e n - h e x a n e at 4 0 ° C o r lo w e r. D i s s o l v e t h e r es i d u e i n 5 ml
              o f n - h e x an e .
            i i i . Te a s exc e p t ma t c h a
              We i g h 9 .0 0 g o f t h e te s t s a mp l e a n d s o a k i t i n 5 4 0 ml o f w a t e r a t
              1 0 0 ° C , a nd t h en le a v e i t t o s t an d at r o o m t e mp e r a t u r e f o r f i v e
              mi n u t e s . Tra n s f e r 3 60 ml o f t h e co o l ed f i lt r at e in t o a 5 0 0 - ml c o n i ca l
              flask.
              A d d 3 0 ml o f p ho s p h o r i c a c id , 1 0 0 ml o f a c e to n e an d 2 ml o f
              s a t u r a t e d le a d a ce t a te s o l u ti o n to t h e a b o v e c o n i c a l f l a s k , a n d th e n
              l e a v e th e mi x t u r e t o s ta n d f o r o n e h o u r at r o o m t e mp e r a t u r e . F i lt e r
              t h e mi x t u r e b y s u ct i o n i n to a 1 , 00 0 - ml s e p ar a t i n g f u nne l th r o u gh a
              f i l t e r p a p e r c o v e r ed w i t h a 1 - c m t h i ck l a y e r o f d i a to ma c e o u s ea r t h .
              Wa s h t h e ab o v e co n i ca l f l a s k w it h 5 0 ml o f a c e t o n e an d w a s h t h e
              residue on the surface of the filter paper with the washings. Add the
              w a s h i n g s in t o th e a b o v e s e p a r a t i n g f u n n el a n d a l so a d d 3 0 g o f
              s o d i u m c h l o r i d e an d 1 0 0 ml o f n - h e x an e . S h a k e t h e mi x t u r e
              v i g o r o u s l y f o r f i v e mi n u t e s u s i n g a s h a k e r an d l ea v e i t t o s t a nd , and
              t h e n t r a n s f e r t h e n - h ex a n e l a y e r t o a 3 0 0 - ml c o n ic a l f l a s k . A d d 1 0 0
              ml o f n - h e x a n e t o t h e aq u e o u s l a y e r a n d r e p ea t t h e a b o v e p r o c e d u r e,
              a n d th e n a d d t h e n - h e xa n e l a ye r to t h e c o ni ca l f l a s k a bo v e . A d d an
              a d e q u a t e amo u n t o f s o d i u m s u l f a t e ( a n h ydr o u s ) t o t h e f l a s k a nd
              l e a v e it t o s t a n d f o r 1 5 mi n u t e s w i t h o c c a s io n a l s h ak i n g . F i l t e r t h e



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Provisional Translation
from the Japanese Original


              c o n te n t o f th e f l a s k i n to a r o t a r y v a c u u m e v a p o r a t o r. Wa s h t h e f l a s k
              w i t h 2 0 ml o f n - h e x an e a n d w a s h t w i c e t h e re s i d u e o n th e s u r f a c e o f
              t h e f il t e r p a p e r w i t h th e w a s h in g s . A d d t h e w a s h i n g s in t o t h e r o tar y
              v a c uu m e v a p o r a to r a n d r e mo v e t h e n - h e xa n e a t 40 °C o r l o w e r.
              D i s s o l v e t he r e s i d u e in 5 ml o f n - h e x a n e.
            i v. F o o d s ex c e p t t h o s e l i st e d i n i t o i ii a b o v e
              O b t a i n t h e e x t r a c t s acc o r d i n g to t h e me t h o d s d e s c r i b e d i n i o r i i .
          b . C l ea n - u p
            A d d 5 g o f f l o r i s i l f o r c o l u mn c h r o ma t o g r a p h y s u s p e n d ed i n n - h ex an e
            i n t o a c h ro ma t o g r a p h t u b e ( 1 5 m m i n i n n e r d i a me t e r, 3 0 0 m m i n
            l e n gt h ) a nd a d d ov e r ap p r o x i ma t e l y 5 g o f s o d i u m s u l f a t e ( a n h y d r o u s )
            i n t o th e c o l u mn . S p i l l o u t t h e n -h e x an e u n ti l o n l y a s ma l l a mo u n t
            r e ma i n s o n t h e p a ck i ng o f t h e co l u mn a n d p o u r t h e s o l u tio n o b t ai n ed
            b y t h e ex t ra c t i o n d e s cr i b e d in 4 - a i n to t he c ol u mn . T h e n, p o u r 1 0 0 m l
            o f n - h e x an e i n to t h e co l u mn a n d d i s c a r d th e e ff l u e n t . P o u r 1 50 ml o f
            e t h y l a c e tat e / n - h ex a n e ( 1 : 9 ) i n t o t h e c o lu mn a n d co l l ec t t h e el u at e
            i n t o a r o tar y v a c u u m e v a p o r a t o r, a n d t h en r o mo v e t h e e t h y l a c e tat e
            a n d n - he x an e a t 40 ° C o r l o w e r. D i s s o l v e t h e r e s i d u e in n - h e x a n e t o
            ma k e e x a c tl y 5 ml o f s o l u ti o n, w hi c h i s u s e d a s t h e s a mp l e s o lu t i o n .
        5 . D e t e r mi n a t io n
          a . Q u a l i ta t iv e t e s t s
            P e r f o r m q u a l i t at i v e t es t s u n d e r th e f o l l o w in g c o n d i t io n s . Te s t r e s u l t s
            o b t ai n ed mu s t b e t h e s a me a s t h o s e o b t a i n ed f o r t h e r e f e r e n c e
            standard.
            Te s t i n g c o n d i t io n s 1
            C o l u mn : A s i l i c at e g la s s c a p i ll a ry c o l u mn ( 0 . 2 5 mm i n n e r d i a me t e r,
              10-30         m      in     le n g th )    c o a te d    with       me t h y l      s i l i co n e   for     gas
              c h r o ma t o g r a p h y t o a th i c kn e s s o f 1 . 5 µ m.
            C o l u mn t e mp e r a t u r e : H o l d t h e c o l u mn t e mp e r a t u r e a t 5 0 ° C f o r o n e
              mi n u t e , f o ll o w e d b y an i n c r e a s e o f 2 5 ° C ev er y mi n u t e u n t i l r e ac h in g
              1 7 5 ° C , a f t er w h i c h in cr e a s e t h e te mp e r a t u r e b y 1 0 ° C ev e r y mi n u t e
              u n t il r e a c h in g 3 0 0 ° C , a n d h o ld f o r f i v e mi n u t e s .
            I n l e t t e mp e r a t u r e : 2 3 0 ° C
            D e t e c t o r : Op e r a t e at 3 0 0 ° C
            G a s f l o w r a t e : U s e h el i u m a s t h e c a r r i e r g a s . A d j u s t t h e f l o w r a t e t o
              t h e o p t i ma l c o n d i t io n .
            Te s t i n g c o n d i t io n s 2



                                                           27/100
Provisional Translation
from the Japanese Original


            C o l u mn : A s i l i c a te g l as s c a p i ll a r y c o lu mn ( 0 . 2 5 mm i n i n n e r d i a me t e r,
              1 0 - 3 0 m i n l e n g th ) c o a t e d w i t h 5 % p h e n y l me t h y l s i l i c o n e f o r g as
              c h r o ma t o g r a p h y t o a th i c kn e s s o f 0 . 2 5 µ m.
            C o l u mn t e mp e r a t u r e : H o l d t h e c o l u mn t e mp e r a t u r e a t 5 0 ° C f o r o n e
              mi n u t e , f o ll o w e d b y an i n c r e a s e o f 2 5 ° C ev er y mi n u t e u n t i l r e ac h in g
              1 2 5 ° C , a f t er w h i c h in cr e a s e t h e te mp e r a t u r e b y 1 0 ° C ev e r y mi n u t e
              u n t il r e a c h in g 3 0 0 ° C , a n d h o ld f o r t h r e e mi n u t e s .
            I n l e t t e mp e r a t u r e : 2 3 0 ° C
            D e t e c t o r : Op e r a t e at 3 0 0 ° C
            G a s f l o w r a t e : U s e h el i u m a s t h e c a r r i e r g a s . A d j u s t t h e f l o w r a t e t o
              t h e o p t i ma l c o n d i t io n .
          b . Q u a n ti t at i v e t e s t s
            D e t e r mi n e t h e q u an t i ty f r o m t h e t e s t r e s u lt s o b ta i n e d u n d e r th e s ame
            c o n d i t io n s d e s c r i b ed in 5 - a u si n g e i t he r t h e p e a k h e ig h t o r p e ak a re a
            me t h o d .
          c . C o n f i r ma t i o n t e s t s
            P e r f o r m g a s c h r o ma t o g r a p h y / ma s s s p e c t ro me t r y u n d e r t h e s am e
            c o n d i t io n s d e s c r i b ed in 5 - a . Te s t r e s u l t s o bt ai n e d mu s t b e t h e s a me a s
            t h o s e o b t a in e d f o r t h e r e f e r e n c e s t a nd a r d . D e t e r mi n e t h e q u an t ity
            u s i n g e i th er t h e p ea k h e i gh t o r pe a k a r e a me t h od , i f r eq u i r e d .

      ( 7 ) C a r b a d o x an a l y t i ca l me t h o d
            A n a l yz e q ui n o xa l in e - 2- c a r b o x y l i c a c i d .
        1. Apparatus
          A     h i g h - p er f o r ma n c e     l i q u id     ch r o ma t o g r a p h   with    an     u l t r av io l e t
          s p e c t r o p h o to me t r i c d e te c t o r ( H P L C -U V ) a n d a l iq u i d ch r o ma t o g r a p h /
          m a s s s p e c t r o me t e r ( L C / M S o r L C / M S / M S )
        2 . R e ag e n t s a n d t e s t s o l u t io n s
          I n a d d i t io n t o t h e r e ag e n t s a n d te s t s o lu t i o n s l i s t ed b e l o w, u s e th o s e
          l i s t e d in S e c t i o n C R e a g e n ts /Te s t S o l u ti o n s , E t c . , P a r t I I F o o d
          a d d it i v e s . R e a g en t s d e s i g n at e d as “s p e c i a l g r a d e ” i n th i s s e c ti o n mu s t
          me e t t h e re q u i r e me n t s f o r “s p e c i a l g r a d e” s p e c i f ie d i n t h e J ap a n
          I n d u s t r i a l St a n d a r d s fo r t h e r e ag e n t s .
          O c t a d e c y l si l a n e - b o n d e d s i l ic a g e l cartridge c o l u mn ( 5 0 0 mg ) : A
            p o l y e t h y l en e c o l u mn o f 8 - 9 mm i n i nn e r d i ame t e r p a c k e d w i t h 5 0 0 mg
            o f o c t a d ecy l s i l a n e - b o n d e d s i li c a g e l , o r a c o l u mn e q u i v al e n t to t h e
            s p e c i f i e d o n e i n s e p a ra t i o n c ap a b i l i t y.
          St r o n g l y b a s i c      an i o n e x ch a n g er        cartridg e c o l u mn ( 3 6 0 mg ) : A


                                                               28/100
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