BÜHLMANN fCAL - BÜHLMANN Laboratories AG
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BÜHLMANN fCAL®
ELISA
Calprotectin
EK-CAL2-WEX 192 tests
Revision date: 2018-04-10
BÜHLMANN Laboratories AG English page 2
Baselstrasse 55 Deutsch page 9
4124 Schönenbuch, Switzerland Français page 16
Tel.: +41 61 487 1212 Italiano page 23
Fax: +41 61 487 1234 Español page 30
info@buhlmannlabs.ch Português page 37Reagents Quantity Code Reconstitution
ENGLISH TMB Substrate 2 vials
B-TMB12 Ready to use
TMB in citrate buffer x 12 mL
INTENDED USE Stop Solution 2 vials Ready to use
B-STS12
0.25 M sulfuric acid x 12 mL Corrosive agent
The BÜHLMANN fCAL®
ELISA is an in vitro diagnostic test
for the quantitative determination of calprotectin in human Table 1
stool specimens intended as an aid to the assessment of 1)
The actual calprotectin concentration of the standards A to E are 4, 12,
intestinal mucosal inflammation. The assay results can be 40, 120 and 240 ng/mL, respectively. For extraction and subsequent
used as an aid to diagnosis in distinguishing organic, sample dilution, a dilution of 1:2500 was taken into account for the
assignment of calibrator A to E. For the lower range ELISA procedure
inflammatory disease of the gastrointestinal tract the calibrator values have to be set as: 10, 30, 100, 300 and 600 µg/g
(inflammatory bowel disease, IBD, e.g. Crohn’s disease or calprotectin.
2)
ulcerative colitis, UC) from functional disease (irritable If you choose the extended range ELISA procedure the nominal
bowel syndrome, IBS) (ref. 1-7), in patients with chronic calibrator values have to be set as: 30, 90, 300, 900 and 1800 µg/g
calprotectin.
abdominal pain, above the age of four (ref. 8-9), and as an 3)
The controls contain lot specific amounts of native human calprotectin.
aid to IBD disease monitoring (ref. 10-20). Refer to the additional QC data sheet for actual concentrations.
For laboratory use only.
STORAGE AND SHELF LIFE OF REAGENTS
PRINCIPLE OF THE ASSAY
Unopened reagents
The BÜHLMANN fCAL® ELISA allows the selective Store at 2-8 °C. Do not use the reagents beyond the expiration date
measurement of calprotectin in fecal extracts by sandwich printed on the labels.
ELISA. The microtiter plate of the BÜHLMANN fCAL® Opened / Reconstituted reagents
ELISA is coated with a monoclonal capture antibody (mAb)
Extraction Buffer Store at 2-8 °C until expiration date.
highly specific to the calprotectin heterodimeric and
polymeric complexes. Patient fecal sample extracts, Return unused strips immediately to the foil
pouch containing the desiccant packs and reseal
controls for determination of ELISA run acceptability, and Microtiter Plate along the entire edge of zip-seal.
calibrators are loaded onto wells of the microtiter plate. Store until expiration date at 2-8 °C.
After a 30 minute incubation at room temperature and
Diluted Wash Buffer Store for up to 6 months at 2-8 °C.
washing steps, a detection antibody (Ab) conjugated to
horseradish peroxidase (HRP) detects the calprotectin Incubation Buffer
molecules bound to the capture antibody on the plate. After Calibrators
incubation and further washing steps, the chromogenic Controls
HRP substrate, tetramethylbenzidine (TMB) is added (blue Store at 2-8 °C until expiration date.
Enzyme Label
color formation) followed by a stopping reaction (change to
TMB Substrate
yellow color). The absorption is measured at 450 nm. The
final calprotectin concentration in µg/g stool in the patient Stop Solution
samples is determined using the calibration curve Table 2
generated from the measured calibrator values.
REAGENTS AND MATERIALS SUPPLIED
REAGENTS SUPPLIED AND PREPARATION SUPPLEMENTARY
Reagents Quantity Code Reconstitution
Fecal extraction device
Microtiter Plate The fecal extraction device described in table 3 is not
precoated with anti- 2 x 12 x 8 wells B-CAL-MP Ready to use delivered with the kit and has to be ordered seperatly.
calprotectin mAb
Plate Sealer 6 pieces - Ready to use Extraction Device Quantity Code
Wash Buffer 2 bottles Dilute each with
Package with 50, 200 or 500 B-CALEX-C50
Concentrate (10x) B-CAL-WB 900 mL of
with preservatives x 100 mL deionized H2O CALEX® Cap tubes respectively, each
B-CALEX-C200
Device filled with extraction buffer,
Incubation Buffer 3 bottles B-CALEX-C500
B-CAL-IB Ready to use 5 mL / ready to use
with preservatives x 125 mL
Table 3
Calibrators
A to E1) 2)
5 vials B-CAL-
Calprotectin in a Ready to use
x 1 mL CASET
buffer matrix with
preservatives
Control Low / High3)
2 vials B-CAL-
Human serum with Ready to use
x 1 mL CONSET
preservatives
Enzyme Label
2 vials
Anti-calprotectin Ab B-CAL-EL Ready to use
x 12 mL
conjugated to HRP
Revision date: 2018-04-10 2/52 BÜHLMANN fCAL®ELISA• Read carefully the instructions prior to carrying out the
MATERIALS REQUIRED BUT NOT PROVIDED test. Test performance will be adversely affected, if
reagents are incorrectly diluted, modified or stored under
Extraction procedure conditions other than those as detailed in this instruction
• 10 µL disposable inoculation loops for use.
• 15 mL polypropylene tubes with screw caps required for • Components must not be used after the expiry date
standard extraction procedure; extraction devices (see printed on the labels.
above).
• Do not mix different lots of reagents.
• Laminar flow work station
• Every effort should be made to ensure that no cross
• Multi tube vortex mixer contamination occurs between reagents, samples or
• Precision balance (10-150 mg) between wells.
• Micro centrifuge (≥3000 x g) • Allow the reagents to equilibrate to room temperature.
Mix well (vortex) the reagents before use.
• Centrifuge (≥500 x g)
• Microwells cannot be re-used.
ELISA procedure
• 10, 100 and 1000 µL precision pipettes with disposable Extraction
tips • In order to receive reliable and quantitative results it is
important to homogenize the stool sample entirely in the
• Disposable polystyrene or polypropylene tubes for the
exctraction device. Insoluable (undigested) components
preparation of sample dilutions
may still be present after extraction.
• 1000 mL cylinder to dilute the wash buffer
ELISA procedure
• Microtiter plate washer (see Technical Precautions) or
squeeze bottle for wash buffer • In the ELISA procedure the washing step is essential to
guarantee reproducible results. A minimal incubation
• Microtiter plate rotator (see Technical Precautions) time of the wash buffer in the wells of at least 20
• Blotting paper seconds must be ensured each time.
• Microtiter plate reader for measurement of absorbance • When using an automated washer, BÜHLMANN strongly
at 450 nm recommends using “plate mode” i.e. each process step
(dispense/aspiration) is performed on all of the strips
PRECAUTIONS sequentially, before proceeding to the next process step.
Thus, the minimal incubation time is guaranteed.
Safety precautions
• The indicated number of washing cycles is mandatory to
• The calibrators and controls of this test contain
ensure reproducible results.
components of human origin. Although tested and found
negative for HBV surface antigen, HCV and HIV1/2 • Set the plate rotator (shaker) at 450 rpm (SPECIMEN COLLECTION AND STORAGE
If the extraction devices are used, less than 1 g of native
stool specimen is needed for the extraction procedure.
Stool specimens should be collected into plain tubes.
Important: The specimen must be collected without any
chemical or biological additions in the collection device.
Specimen transport
Stool specimens should be received by the laboratory within
3 days of collection. The specimens may be transported at
room temperature (23 °C).
1.` Sample dilution option 2:
Specimen storage
Working range 30-1800 µg/g
Received stool specimens should be stored at 2-8 °C and
The working range can be extended by a factor of 3, if you
extracted within 3 days.
dilute the samples 1:7500 instead of 1:2500. This procedure
Extract storage is recommended, if high calprotectin concentrations are to
Calprotectin in extracts obtained by the BÜHLMANN be expected. The precision, linearity and analytical
CALEX® Cap is stable at room temperature for 3 days, at 2- sensitivity of the extended range ELISA have been
8 °C for 6 days and at -20 °C for 18 months. validated. The results of the validation (please refer to the
performance characteristics section) support the extension
STOOL SAMPLE EXTRACTION of the measuring range to 30-1800 µg/g.
The extraction procedure is described and illustrated in the 1.1` After extraction with the CALEX® Cap Device, dilute
instruction for use delivered with the respective extraction the stool extracts 1:15 with incubation buffer (e.g.
device. 50 µL extract and 700 µL incubation buffer) and mix
well. Let the samples equilibrate for at least 5 minutes
CALEX® Cap Device (Code B-CALEX-C50 / B-CALEX- at 18-28 °C prior to proceeding to step 4c.
C200 / B-CALEX-C500): The extraction tubes are prefilled
with extraction buffer.
Important: After extraction, centrifuge the CALEX® Cap
Device for 5 minutes at 500-3000 x g and continue with the
assay procedure.
WORKING RANGE
The assay can be performed according to the following
procedures; lower or extended range ELISA procedure.
Which procedure is to be chosen depends on the expected
calprotectin concentration of the samples. For samples up
to 600 µg/g choose the lower range procedure (working 2. Prepare a plate with sufficient strips to test the required
range 10-600 µg/g). If the samples tend to exceed 600 µg/g number of calibrators, controls and diluted samples.
choose the extended range procedure (working range 30- Remove excess strips from the holder and re-seal them
1800 µg/g). in the foil pouch together with the desiccant packs
without delay. Store refrigerated.
ASSAY PROCEDURE 3. Wash the coated wells twice using at least 300 µL of
Important: Allow the reagents to equilibrate to 18-28 °C wash buffer per well. Empty the wells and tap the plate
prior to use. Only dilute stool extracts. Standards and firmly onto blotting paper.
controls are ready to use. Important: For every of the three wash steps a minimal
1. Sample dilution option 1: incubation time of at least 20 seconds of the wash buffer in
Working range 10-600 µg/g the wells must be ensured (see technical precautions –
1.1. After extraction with the CALEX® Cap Device, dilute ELISA procedure).
the stool extracts 1:5 with incubation buffer (e.g.
100 µL extract and 400 µL incubation buffer) and mix
well. Let the samples equilibrate for at least 5
minutes at 18-28 °C prior to proceeding to step 4c.
Revision date: 2018-04-10 4/52 BÜHLMANN fCAL® ELISA4a. Pipet 100 µL of incubation buffer (blank) and 12. Pipet 100 µL of stop solution to all wells. Remove air
Pipet 100 µL of Calibrator A-E into the respective wells. bubbles with a pipette tip. Proceed to step 13 within 30
min.
4b. Pipet 100 µL of the controls low and high into the
respective wells. 13. Read the absorbance at 450 nm in a microtiter plate
reader.
4c. Pipet 100 µL of each diluted sample into the subsequent
wells.
5. Cover the plate with a plate sealer, and incubate for
30 + max. 5 min on a plate rotator set at 450 rpm at
18-28 °C (see Technical Precautions – ELISA
Procedure).
6. Remove and discard the plate sealer. Empty the wells
and wash three times using at least 300 µL of wash
buffer per well (see Technical Precautions – ELISA
Procedure). Empty the wells and tap the plate firmly onto
blotting paper.
QUALITY CONTROL
Thorough understanding of this instruction is necessary for
the successful use of the product. Reliable results will be
obtained only by precise laboratory techniques (current
GLP guidelines) and accurately following this instruction for
use.
Since there is no control for calprotectin commercially
available, we recommend using a pool of positive stool
extracts for internal quality control.
The reproducibility of standard curve parameters and
control values should be within established limits of
7. Pipet 100 µL of enzyme label to each well. laboratory acceptability. The confidence limits for the
8. Cover the plate with a plate sealer, and incubate for 30 controls are lot-specific and printed on the additional QC
±5 min on a plate rotator set at 450 rpm at 18-28 °C. data sheet.
9. Remove and discard the plate sealer. Empty the wells If the performance of the assay does not meet the
and wash five times using at least 300 µL of wash buffer established limits and repetition has excluded errors in
per well. Empty the wells and tap the plate firmly onto technique, check the following issues: i) pipetting,
blotting paper. temperature controlling and timing ii) ELISA reader settings
iii) expiration dates of reagents iv) storage and incubation
conditions v) TMB substrate solution should be colorless vi)
purity of water.
STANDARDIZATION
The BÜHLMANN fCAL® ELISA calibrator values are
assigned in multiple measurement runs using internal
reference material based on human serum and the
BÜHLMANN fCAL® ELISA measurement procedure. The
calprotectin concentration of the internal reference material
Important: Allow the TMB substrate solution to equilibrate to was established using purified MRP8/14 from human
18-28 °C. granulocytes as primary reference material.
10. Pipet 100 µL of the TMB substrate solution to all wells.
11. Cover the plate with a plate sealer, protect the plate from RESULTS AND CALCULATION
direct light and incubate for 15 ±2 min on a plate rotator Read the absorbance at 450 nm in a microplate reader for
set at 450 rpm at 18-28 °C. each calibrator, control and sample using a 4 PL fit with
blank subtraction and have the concentration of the
samples calculated.
Working range 10-600 µg/g
If you choose the lower range ELISA procedure, the
calibrator concentrations have to be set as: 10, 30, 100, 300
and 600 µg/g calprotectin. Additional dilution factors (if
using a different final dilution than 1:2500) have to be
multiplied with the results to obtain the final results.
Revision date: 2018-04-10 5/52 BÜHLMANN fCAL® ELISARefer to table 7 and figure 1 for typical data (results and Values below 50 µg/g:
standard curve). These results and standard curve are
Calprotectin values below 50 µg/g are not indicative of
provided for demonstration purposes only. A standard curve
inflammation in the gastrointestinal tract. Patients with low
must be generated for each set of samples to be assayed.
calprotectin levels are likely not to be in need of invasive
Working range 30-1800 µg/g procedures to determine the inflammation cause (ref. 5).
If you choose the extended range ELISA procedure, the Elevated values between 50 and 200 µg/g:
following nominal calibrator values have to be set as: 30, Calprotectin values between 50 and 200 µg/g can represent
90, 300, 900 and 1800 µg/g calprotectin. Additional dilution
mild organic disease such as inflammation caused by
factors (if using a different final dilution than 1:7500) have to
NSAIDs, mild diverticulitis and IBD in remission phase. The
be multiplied with the results to obtain the final results.
low inflammatory response shown within this range may
Refer to table 9 and figure 5 for typical data (results and
suggest repeating the measurement and performing further
standard curve). These results and standard curve are investigations.
provided for demonstration purposes only. A standard curve
must be generated for each set of samples to be assayed. Elevated values above 200 µg/g:
Calprotectin values above 200 µg/g are indicative of active
LIMITATIONS organic disease with inflammation in the gastrointestinal
tract. Appropriate further investigative procedures by
• Reagents delivered with the BÜHLMANN fCAL® ELISA specialists are suggested.
kit are intended for the determination of calprotectin
levels in human stool samples only. The cut-off level suggested for adults (50 µg/g) can also be
used for children aged from 4 to 17 years regardless of sex
• Test results should be interpreted in conjunction with (ref. 8-9).
information available from clinical assessment of the
patient and other diagnostic procedures.
INTERPRETATION OF RESULTS
• For IBD disease monitoring, multiple fecal calprotectin
measurements performed at up to 4 weeks intervals IBD MONITORING
have been suggested to have best diagnostic accuracy The determination of fecal calprotectin is also a reliable and
in predicting clinical relapse in patients (ref. 21-22). simple way to assist the monitoring of IBD patients (ref. 10-
• Patients who are taking NSAIDs regularly may have 20).
elevations in their fecal calprotectin levels. Correlation of calprotectin levels and the inflammatory
status of patient’s intestinal mucosa, according to
INTERPRETATION OF RESULTS endoscopic evaluations, were determined in three
independent studies using BÜHLMANN calprotectin tests
DISTINGUISHING ORGANIC DISEASE FROM
(table 5). The diagnostic value of calprotectin in predicting
FUNCTIONAL GASTROINTESTINAL DISEASE clinical remission and relapse, according to patient`s
Determination of fecal calprotectin is a reliable and easy symptoms, clinical activity indices, unplanned need for
way to distinguish organic from functional gastrointestinal therapy escalation, hospitalization or emergency was
diseases (ref. 1-7). determined in three studies using BÜHLMANN calprotectin
The following data were established with the BÜHLMANN tests (table 6).
fCAL® ELISA (order code: EK-CAL). In a clinical study, fecal Condensed knowledge of published cut-offs and the above
calprotectin values of 344 symptomatic patients were clinical performance studies support the following result
compared with endoscopic findings. Endoscopy categories:
examination showed 264 patients with functional diseases Values below 100 µg/g:
whereas 80 patients had various organic diseases (colitis,
Fecal calprotectin levels below 100 µg/g can reliably
Crohn’s, ulcers, diverticulitis, polyps, adenomas, cancer, or
indicate patients, with low risk of clinical relapse, in
infectious diseases) (ref. 5).
endoscopic remission for whom invasive endoscopic
ROC curve analysis (AUC: 0.962) resulted in an optimal
procedures can be avoided (ref. 10-20).
clinical cut-off at 50 µg/g. Applying this cut-off, a clinical
sensitivity and specificity of 88.8 % and 93.6 %, respectively Values between 100-300 µg/g:
can be reached in the differentiation between organic and Fecal calprotectin levels between 100-300 µg/g may
functional diseases (refer to table 4). indicate the necessity of tighter control in the following
Fecal calprotectin levels from adults and children are period to assess disease development tendencies.
comparable, whereas levels of newborns can be
significantly increased (ref. 8-9). Values above 300 µg/g:
These data support the following recommendation for Fecal calprotectin levels above 300 µg/g should be
interpretation of results: repeated and, if raised levels are confirmed, prompt further
investigative procedures (ref. 10-20).
Revision date: 2018-04-10 6/52 BÜHLMANN fCAL® ELISAThe above result categories are recommendations. It is Linearity: 10-600 µg/g
advised that healthcare practitioners establish individual Assay linearity was assessed according to CLSI-approved
patient thresholds by determining the patient’s baseline guideline EP6-A. Four extracted stool samples with
calprotectin level during disease remission. concentrations higher than 600 µg/g were diluted in
A false negative result that is a calprotectin result below incubation buffer. For each sample up to 17 dilutions in the
100 µg/g category that should show a value above range of 1:2500 (lowest recommended dilution) up to
300 µg/g, for a patient with endoscopic inflammation, 1:500000 were performed. Linearity results for one of the
although unlikely, may delay appropriate clinical decisions extracted stool samples are presented in figure 3.
and patient treatment. Therefore, it is important that the Spiking recovery. Total bias: -1.1 %; Lower Limit of
patient remains under the care of a healthcare practitioner Agreement: -17.5 %, Upper Limit of Agreement: 15.4 %
and reports any clinical symptoms. Four negative extracted stool samples were spiked with
Studies have shown that high calprotectin levels, above increasing amounts of calprotectin from serum specimens.
300 µg/g, will not always indicate development of a clinical The results are presented in figure 4.
relapse (ref. 10-20). High calprotectin levels should be
treated as a red flag signal and repeated. Confirmation of Working range: 30-1800 µg/g
raised levels should prompt further investigative Intra-assay precision: 2.6 %-10.5 % CV
procedures.
The intra-assay precision was validated by testing twelve
extracted stool samples in 20 duplicates within a single run
PERFORMANCE CHARACTERISTICS according to the assay procedure. The values are
Working range: 10-600 µg/g presented in table 10.
Repeatability: 1.8-5.9 % CV Inter-assay precision: 7.8-12.8 % CV
Within-laboratory precision: 5.3 %-10.0 % CV The inter-assay precision of the ELISA was calculated from
Repeatability and within-laboratory precision was five extracted stool samples. The aliquots were tested
determined according to the CLSI approved guideline EP5- according to the assay procedure in ten different runs by
A2. Nine extracted stool samples were tested in duplicate three technicians using two kit lots in two different labs. The
according to assay procedure in a period of over 20 days. values are presented in table 11.
One run per day was performed. The values are presented Limit of Blank (LoB):General performance characteristics High dose hook effect An extracted stool sample with a calprotectin concentration of 14000 µg/g and a serum sample with a calprotectin concentration of 60000 µg/g, that is 100 times higher than the highest calibrator E (600 µg/g), were tested undiluted and in serial dilutions. No high dose hook effect was observed. The results for the extracted stool sample are presented in figure 8. Crossreactivity:
Reagenz Menge Code Rekonstitution
DEUTSCH
Kalibratoren
A-E1) 2)
ANWENDUNGSZWECK Calprotectin in 5 Röhrchen B-CAL-
Gebrauchsfertig
proteinhaltigem x 1 mL CASET
Der BÜHLMANN fCAL®
ELISA ist ein in vitro Diagnosetest, Puffer; Konser-
für die quantitative Bestimmung von Calprotectin in vierungsmittel
humanen Stuhlproben und ist zur Unterstützung der Kontrolle tief / hoch3)
2 Röhrchen B-CAL-
Beurteilung einer Entzündung der Darmschleimhaut Humanserum mit Gebrauchsfertig
x 1 mL CONSET
vorgesehen. Die Testergebnisse können zur Unterstützung Konservierungsmittel
dienen bei der Diagnose zur Unterscheidung einer Enzymmarker
2 Röhrchen
organischen, entzündlichen Erkrankung des Magen-Darm- anti-Calprotectin Ak B-CAL-EL Gebrauchsfertig
x 12 mL
Traktes (entzündliche Darmerkrankungen; z.B. Morbus konjugiert mit HRP
Crohn; oder Colitis ulcerosa) von einer funktionellen TMB-Substrat
2 Röhrchen
Erkrankung (Reizdarmsyndrom) (Ref. 1-7) bei Patienten mit Citrat-gepufferte B-TMB12 Gebrauchsfertig
x 12 mL
chronischen Bauchschmerzen, die älter als vier Jahre sind TMB-Lösung
(Ref. 8-9). Die Testergebnisse können auch zur Stopp-Lösung
2 Röhrchen Gebrauchsfertig
Unterstützung bei der Überwachung entzündlicher 0,25 M B-STS12
x 12 mL korrosiv
Darmerkrankungen (Ref. 10-20) verwendet werden. Schwefelsäure
Tabelle 1
Nur für Laborzwecke. 1)
Die tatsächliche Konzentrationen der Kalibratoren A-E betragen 4, 12,
40, 120 und 240 ng/mL Calprotectin. Für die Extraktion und die
PRINZIP DER METHODE Probenverdünnung wurde eine Gesamtverdünnung von 1:2500 bei den
Konzentrationen der Kalibratoren A-E bereits berücksichtigt. Für die
Der BÜHLMANN fCAL® ELISA ermöglicht die selektive „Lower Range“ ELISA Variante Im unteren Bereich müssen die
Kalibratorwerte wie folgt eingestellt werden: 10, 30, 100, 300 und
Messung von Calprotectin in Stuhlprobenextrakten mit dem 600 µg/g Calprotectin.
Sandwich-ELISA. Die Mikrotiterplatte des BÜHLMANN 2)
Wenn Sie die „Extended Range“ ELISA Variante verwenden, müssen die
fCAL® ELISAs ist mit einem monoklonalen nominalen Kalibratorwerte wie folgt eingestellt werden: 30, 90, 300, 900
Fängerantikörper beschichtet, der hochspezifisch für die und 1800 µg/g Calprotectin.
3)
Die Kontrollen enthalten Lot-abhängige Konzentrationen von nativem,
heterodimeren und polymeren Calprotectinkomplexe ist. humanem Calprotectin. Die genauen Konzentrationen werden auf dem
Stuhlprobenextrakte von Patienten, Kontrollen zur QC Datenblatt angegeben.
Bestimmung der ELISA Messakzeptanz und Kalibratoren
werden in die Wells der Mikrotiterplatte geladen. Nach einer LAGERUNG UND HALTBARKEIT DER REAGENZIEN
30-minütigen Inkubationszeit bei Raumtemperatur und nach
den Waschschritten bindet ein Detektionsantikörper, der an Ungeöffnete Reagenzien
Meerrettichperoxidase (HRP) gekoppelt ist, an die Bei 2-8 °C lagern. Zu verwenden bis zum Verfallsdatum, angegeben auf
Caplprotectinmoleküle, die wiederum an die der Packungsetikette.
Fängerantikörper auf der Platte gebunden sind. Nach der Geöffnete / rekonstituierte Reagenzien
Inkubation und weiteren Waschschritten wird das Extraktionspuffer Bis zum Verfallsdatum bei 2-8 °C lagern.
chromogene HRP-Substrat und Tetramethylbenzidin (TMB)
Ungebrauchte Streifen sofort in die mit
hinzugefügt (Bildung einer blauen Farbe); danach wird die Trockenmittel versetzte Packung zurücklegen.
Mikrotiterplatte
Reaktion gestoppt (Farbumschlag nach gelb). Die Packung gut verschliessen. Bei 2-8°C bis zum
Absorption wird bei 450 nm gemessen. Die endgültige Verfallsdatum haltbar.
Calprotectinkonzentration in µg/g Stuhl in den Waschpuffer
Bei 2-8 °C bis 6 Monate nach der Verdünnung
Patientenproben wird mithilfe der Kalibrierkurve ermittelt, lagern.
die anhand der gemessenen Kalibratorwerte erstellt worden Inkubationspuffer
ist. Kalibratoren
Kontrollen
GELIEFERTE REAGENZIEN UND VORBEREITUNG Bis zum Verfallsdatum bei 2-8 °C lagern.
Enzymmarker
Reagenz Menge Code Rekonstitution
TMB-Substrat
Mikrotiter-platte
Stopp-Lösung
Beschichtet mit anti- 2 x 12 x 8 Wells B-CAL-MP Gebrauchsfertig
Calprotectin mAk Tabelle 2
Abdeckfolien 6 Stück - Gebrauchsfertig
Waschpufferkonzent Jede mit
2 Flaschen 900 mL
rat 10x B-CAL-WB
x 100 mL deionisier-tem
Konservierungsmittel H2O verdünnen
Inkubations-puffer 3 Flaschen
B-CAL-IB Gebrauchsfertig
Konservierungsmittel x 125 mL
Revision date: 2018-04-10 9/52 BÜHLMANN fCAL®ELISAKleidung vermeiden. Bei Berührung mit den Augen oder
REAGENZIEN UND MATERIAL ZUSÄTZLICH der Haut sofort mit viel Wasser abwaschen.
ERHÄLTLICH • Reagenzien: Kontakt der Reagenzien mit der Haut, den
Extraktionsprodukt für Stuhlproben Augen oder den Schleimhäuten vermeiden. Im Falle
eines Kontaktes sofort mit reichlich Wasser spühlen,
Das Extraktionsprodukt zur Stuhlextraktion in Tabelle 3 wird
ansonsten kann eine Reizung oder Verätzungen
nicht mit dem Kit mitgeliefert und muss zusätzlich zum Kit
auftreten.
bestellt werden.
• Ungebrauchte Lösungen sollten gemäss den lokalen
Extraktionsprodukte Menge Code gesetzlichen Bestimmungen entsorgt werden.
Packungen zu 50, 200 Technische Vorsichtsmassnahmen
und 500 Röhrchen, B-CALEX-C50
CALEX® Cap gefüllt mit B-CALEX-C200 Kit Komponenten
Extraktionspuffer, B-CALEX-C500
• Auf Grund des Produktionsprozesses kann es
5 mL / gebrauchsfertig
Rückstände in den Wells der Mikrotiterplatten geben.
Tabelle 3
Sie werden mit dem 1. Waschen (Testdurchführung
Schritt 3) entfernt und haben keinen Einfluss auf die
ERFORDERLICHE NICHT IM LIEFERUMFANG Ergebnisse.
ENTHALTENE MATERIALIEN
• Lesen Sie vor der Testdurchführung die Arbeitsanleitung
Extraktion sorgfältig durch. Die Testqualität kann negativ
• 10 µL Einwegimpfschlingen beeinflusst werden, wenn die Reagenzien nicht korrekt
• 15 mL Polypropylen Einwegröhrchen mit Schraubver- verdünnt oder verändert werden, sowie nicht
schluss für die Standardextraktion entsprechend der in dieser Anleitung angegebenen
Lagerungsbedingungen gelagert werden.
• Laminar Flow Arbeitsplatz
• Die Reagenzien dürfen nach Ablauf des Verfallsdatums
• „Multi Tube“ Vortex Mixer nicht mehr verwendet werden.
• Präzisionswaage (10-150 mg) • Mischen Sie nicht Reagenzien verschiedener Lots.
• Mikrozentrifuge (≥3000 x g) • Vermeiden Sie unter allen Umständen, dass es zu
• Zentrifuge (≥500 x g) Kontaminationen zwischen verschiedenen Reagenzien,
Proben und zwischen den Wells kommt.
ELISA
• Präzisionspipetten mit Einwegspitzen für 10, 100 und • Die Reagenzien vor Gebrauch auf Raumtemperatur
1000 µL äquilibrieren lassen und mischen (vortexen).
• Polystyrol oder Polypropylen Einwegröhrchen zur • Mikrotiterstreifen dürfen nicht wiederverwendet werden.
Durchführung von Probenverdünnungen Extraktion
• 1000 mL Messkolben zur Verdünnung des • Um verlässliche, quantitative Resultate zu erhalten, ist
Waschpufferkonzentrats es wichtig, dass die im Extraktionsröhrchen enthaltene
• Mikrotiterplattenwaschautomat oder Spritzflasche für Stuhlprobe vollständig homogenisiert wird. Unlösliche
Waschpuffer (siehe technische Vorsichtsmassnahmen) (unverdaute) Bestandteile können auch nach der
Extraktion verhanden sein.
• Mikrotiterplattenschüttler (siehe technische Vorsichts-
massnahmen) ELISA Prozedur
• Saugfähiges Papier • Die korrekte Durchführung der in der Arbeitsvorschrift
beschriebenen Waschschritte ist essentiell, um
• Mikrotiterplattenphotometer mit optischem Filter
reproduzierbare Resultate zu garantieren. Eine minimale
(450 nm)
Inkubationszeit des Waschpuffers im Well von
mindestens 20 Sekunden muss bei jedem Waschschritt
VORSICHTSMASSNAHMEN eingehalten werden.
Sicherheitsmassnahmen • Wird ein Waschautomat eingesetzt, muss der „Platten-
• Die Kalibratoren und Kontrollen enthalten Bestandteile Modus“ gewählt werden. Das heisst, dass jeder Schritt
humanen Ursprungs. Obwohl sie negativ in Tests für (Einfüllen) erst über die gesamte Platte ausgeführt wird,
HBV Oberflächenantigen, HCV und HIV1/2 Antikörper bevor der nächste Schritt (Absaugen) gestartet wird.
waren, sollten sie gemäss „guter Laborpraxis“ (GLP) als Somit kann die minimale Inkubationszeit gewährleistet
potentiell infektiös behandelt werden und die werden.
entsprechenden Sicherheits-vorkehrungen getroffen • Die angegebene Anzahl von Waschschritten muss
werden. eingehalten werden, um reproduzierbare Resultate zu
• Stopp-Lösung: Die Stopp-Lösung (B-STS12) enthält gewährleisten.
Schwefelsäure (0,25 M). Das Reagenz reizt die Augen,
• Der Mikrotiterplattenschüttler muss auf 450 rpm
Haut und Schleimhäute. Kontakt mit Augen, Haut und
(Rotationsgeschwindigkeit kann zu einer schlechteren Wichtig: Nach der Extraktion werden die Extraktions-
Verdünnungslinearität bei Werten zwischen 300/900 und röhrchen 5 Minuten bei 500-3000 x g zentrifugiert. Danach
600/1800 µg/g führen. Eine Rotationsbewegung sollte mit der Testdurchführung fortfahren.
einer Horizontalbewegung vorgezogen werden.
• Damit die Antigen-Antikörper-Reaktion vollständig MESSBEREICHE
ablaufen kann, muss die Inkubationszeit in Schritt 5 Der Test kann entweder nach der Anleitung für den unteren
mindestens 30 Minuten betragen. Leicht längere Konzentrationsbereich „Lower Range“ ELISA Variante oder
Inkubationszeiten (bis zu 5 Minuten) zeigen keinen der Anleitung für den erweiterten Messbereich „Extended
Einfluss auf das Endresultat. Range“ ELISA Variante durchgeführt werden. Welche
• Die als Enzymmarker verwendete Peroxidase (HRP) Version Sie wählen sollten, hängt von der erwarteten
wird durch Sauerstoff inaktiviert und ist sehr empfindlich Calprotectinkonzentration der Proben ab. Für Proben bis zu
gegen Natriumazid, Thimerosal, Hypochlorsäure und 600 µg/g sollte die Anleitung für den Messbereich 10-
aromatische chlorierte Kohlenwasserstoffe, die im 600 µg/g verwendet werden. Wenn die Konzentration der
Wasser vorkommen können. Daher sollte nur Proben jedoch häufig oberhalb von 600 µg/g liegt, raten wir
deionisiertes oder destilliertes Wasser von hoher zu der Anleitung für den erweiterten Messbereich 30-
Qualität verwendet werden. 1800 µg/g.
• Die Standardkurve muss bei jedem Testansatz bestimmt TESTDURCHFÜHRUNG
werden.
• Falls die Konzentration einer Probe grösser als diejenige Wichtig: Die Reagenzien sollten vor der Verwendung auf
des höchsten Kalibrators (E) ist, muss diese Probe mit eine Temperatur von 18-28 °C äquilibriert werden.
Inkubationspuffer verdünnt und erneut getestet werden. Nur die Stuhlextrakte verdünnen. Kalibratoren und
Der zusätzliche Verdünnungsfaktor muss bei der Kontrollen sind gebrauchsfertig.
Konzentrationsberechnung dieser Probe berücksichtigt 1. Option 1 für die Probenverdünnung:
werden. Messbereich 10-600 µg/g
1.1 Nach der Extraktion mit dem CALEX® Cap
PROBENGEWINNUNG UND LAGERUNG Extraktionsröhrchen werden die Stuhlextrakte 1:5 mit
Wenn Extraktionsröhrchen für die Extraktion verwendet Inkubationspuffer verdünnt (z.B. 100 µL Extrakt +
werden, werden weniger als 1 g native Stuhlprobe benötigt. 400 µL Inkubationspuffer). Nach der Verdünnung gut
mischen und die Proben vor Gebrauch in Schritt 4c
Die Stuhlprobe muss in einem leeren Entnahmeröhrchen mindestens 5 Minuten bei 18-28 °C stehen lassen.
gesammelt werden.
Wichtig: Die Stuhlproben dürfen nicht mit Röhrchen, die
chemische oder biologische Zusätze enthalten, gesammelt
werden.
Transport der Proben
Innerhalb von 3 Tagen nach Gewinnung des
Untersuchungsmaterials sollte es vom Labor erhalten
werden. Die Proben können bei Raumtemperatur
transportiert werden (23 °C).
Lagerung der Proben
Erhaltene Stuhlproben sollten bei 2-8 °C gelagert und
innerhalb von 3 Tagen extrahiert werden.
1.` Option 2 für die Probenverdünnung:
Lagerung des Extraktes Messbereich 30–1800 µg/g
Calprotectin in Extrakten, die mit BÜHLMANN CALEX® Cap Der Messbereich kann um einen Faktor von 3 erweitert
gewonnen wurden, sind bei Raumtemperatur 3 Tage, bei 2- werden, wenn die Proben 1:7500 statt 1:2500 verdünnt
8 °C 6 Tage und bei -20 °C 18 Monate stabil. werden. Diese Testversion wird empfohlen, wenn hohe
Calprotectinkonzentrationen zu erwarten sind. Die
STUHLPROBENEXTRAKTION Präzision, Linearität und analytische Empfindlichkeit des
Extraktion unter Verwendung von „Extended Range“ ELISAs wurde validiert. Die Ergebnisse
Stuhlextraktionsröhrchen der Validierung (Siehe Abschnitt „Leistunbsmerkmale“)
unterstützen die Erweiterung des Messbereichs auf 30-
Die Extraktion ist in den Extraktionsröhrchen beiliegenden
1800 µg/g.
Anleitungen beschrieben und illustriert.
1.1` Nach der Extraktion mit dem CALEX® Cap Device, die
CALEX® Cap (Code: B-CALEX-C50 / B-CALEX-C200 / B-
Stuhlextrakte mit Inkubationspuffer 1:15 verdünnen
CALEX-C500): Die Extraktionsröhrchen sind mit 5 mL
(z.B. 50 µL Extrakt + 700 µL Inkubationspuffer). Nach
Extraktionspuffer gefüllt.
der Verdünnung gut mischen und die Proben vor
Revision date: 2018-04-10 11/52 BÜHLMANN fCAL® ELISAGebrauch in Schritt 4c für mindestens 5 Minuten bei
18-28 °C stehen lassen.
7. 100 µL Enzymmarker zu allen Wells zugeben.
8. Mikrotiterplatte mit einer Folie abdecken und auf einem
Mikrotiterplattenschüttler bei 450 rpm 30 ±5 Min. bei 18-
28 °C inkubieren.
9. Abdeckfolie entsorgen, die Wells entleeren und 5 x mit
2. Eine Mikrotiterplatte mit ausreichender Menge an jeweils mindestens 300 µL Waschpuffer waschen.
Streifen für die Bestimmung von Kalibratoren, Kontrollen Waschpuffer ausschütten und Platte sorgfältig auf
und verdünnten Proben bestücken. Ungebrauchte saugfähigem Papier ausklopfen.
Streifen vom Halter entfernen und unverzüglich mit
Trockenmittel einpacken und gekühlt lagern.
3. Wells zweimal mit jeweils ≥300 µL Waschpuffer
waschen. Waschpuffer ausschütten und Platte sorgfältig
auf saugfähigem Papier ausklopfen.
Wichtig: Eine minimale Inkubationszeit des Waschpuffers
im Well von 20 Sekunden muss bei allen drei
Waschschritten eingehalten werden (siehe technische
Vorsichtsmassnahmen - ELISA).
Wichtig: TMB-Substrat vor dem Gebrauch auf 18-28° C
äquilibrieren lassen.
10. 100 µL TMB-Substrat zu jedem Well zugeben.
11. Mikrotiterplatte zudecken und 15 ±2 Min. bei 18-28 °C
auf einem Mikrotiterplattenschüttler bei 450 rpm
inkubieren. Platte vor direktem Licht schützen.
4a. 100 µL Inkubationspuffer (Blank) in das entsprechende
Well pipettieren.
Je 100 µL Kalibrator A-E in das entsprechende Well
pipettieren.
4b. Je 100 µL Kontrolle tief und hoch in das entsprechende
12. 100 µL Stopp-Lösung zu jedem Well zugeben und
Well pipettieren.
vorhandene Luftbläschen mit Pipettenspitzen entfernen.
4c. Je 100 µL der verdünnten Proben in die nächsten Wells Innerhalb der nächsten 30 Minuten mit Schritt 13
pipettieren. fortfahren.
5. Mikrotiterplatte mit einer Folie abdecken und auf einem 13. Optische Dichte in einem Mikrotiterplattenphotometer
Mikrotiterplattenschüttler bei 450 rpm 30 + max. 5 bei 450 nm messen.
Minuten bei 18-28 °C inkubieren (siehe technische
Vorsichtsmassnahmen - ELISA).
6. Abdeckfolie entfernen, die Wells entleeren und 3 x mit
jeweils mind. 300 µL Waschpuffer waschen (siehe
technische Vorsichtsmassnahmen - ELISA).
Waschpuffer ausschütten und Platte sorgfältig auf
saugfähigem Papier ausklopfen.
Revision date: 2018-04-10 12/52 BÜHLMANN fCAL® ELISAQUALITÄTSKONTROLLE In Tabelle 9 und Abbildung 5 sind Beispiele für Ergebnisse
und die Standardkurve angegeben. Diese Ergebnisse und
Ein vollständiges Verständnis dieser Anleitung ist für den die Standardkurve sind nur als Beispiel gedacht. Sie
erfolgreichen Einsatz des Produktes notwendig. müssen für jeden Ansatz eine Standardkurve ansetzen.
Zuverlässige Resultate werden nur durch die Anwendung
von GLP (aktuelle GLP Richtlinien) und die Einhaltung der LEISTUNGSEINSCHRÄNKUNGEN
Anleitung erreicht.
Da es keine kommerziell erhältlichen Kontrollen für • Die mit dem BÜHLMANN fCAL® ELISA Kit
Calprotectin gibt, wird empfohlen, einen Pool von positiven bereitgestellten Reagenzien sind nur für die Bestimmung
Stuhlextrakten als interne Qualitätskontrolle mitzuführen. der Calprotectinkonzentrationen in humanen
Alle Kontrollen müssen im angegebenen Vertrauensbereich Stuhlproben vorgesehen.
liegen. Die Vertrauensbereiche der Kontrollen sind Lot- • Testergebnisse sollten in Verbindung mit in einer
spezifisch und sind auf dem Kit beiliegenden QC Datenblatt klinischen Beurteilung des Patienten gewonnenen
angegeben. Informationen und sonstigen Diagnoseverfahren
Falls die Ergebnisse des Testes nicht innerhalb der ausgewertet werden.
erwarteten Bereiche liegen und wiederholte Messungen • Um bei der IBD-Überwachung die beste diagnostische
einen Durchführungsfehler ausschliessen, sind folgende Genauigkeit zu erreichen, einen klinischen Rückfall
Punkte zu überprüfen: i) Pipetten, Temperatur und vorherzusehen, wurde empfohlen, mehrere Messungen
Zeitmessung, ii) Photometer Eichung, iii) Verfallsdaten der des fäkalen Calprotectins in bis zu 4 Wochen Intervallen
Reagenzien, iv) Lagerung- und Inkubationsbedingungen, v) durchzuführen (Ref. 21-22).
das TMB-Substrat sollte farblos sein, vi) Wasserreinheit. • Patienten, die regelmäßig NSAIDs einnehmen, haben
möglicherweise erhöhte Calprotectinkonzentrationen im
STANDARDISIERUNG
Stuhl.
Die BÜHLMANN fCAL® ELISA Kalibratorwerte werden in
mehrfachen Messdurchgängen mithilfe von internem INTERPRETATION DER ERGEBNISSE
Referenzmaterial zugewiesen, das auf Humanserum und
dem BÜHLMANN fCAL® ELISA Messverfahren basiert. Die UNTERSCHEIDEN EINER ORGANISCHEN
Calprotectinkonzentration des internen Referenzmaterials ERKRANKUNG VON EINER FUNKTIONELLEN
wurde mithilfe von gereinigtem MRP8/14 aus humanen GASTROINTESTINALEN ERKRANKUNG
Granulozyten als primäres Referenzmaterial ermittelt. Die Bestimmung des Calprotectinspiegels in Stuhlproben
kann als zuverlässige und einfache Hilfe bei der
ERGEBNISSE UND BERECHNUNGEN
Unterscheidung zwischen organischen und funktionellen
Messen Sie die Extinktion bei 450 nm in einem gastrointestinalen Erkrankungen verwendet werden (Ref. 1-
Mikrotiterplattenphotometer für Kalibratoren, Kontrollen und 7).
Proben unter Verwendung eines 4PL Auswertemodus und Die folgenden Daten wurden mit dem BÜHLMANN fCAL®
Leerwert- (Blank) abzug. ELISA erhoben (Bestellcode: EK-CAL). In einer klinischen
Messbereich 10-600 µg/g Studie wurden die Calprotectinwerte von 344
symptomatischen Patienten mit den Ergebnissen einer
Wenn Sie die “Lower Range“ ELISA Variante verwenden,
endoskopischen Untersuchung verglichen.
müssen die Kalibratorkonzentrationen wie folgt eingestellt
Die endoskopische Untersuchung zeigte bei 264 Patienten
werden: 10, 30, 100, 300 und 600 µg/g Calprotectin.
eine funktionelle Erkrankung, während bei 80 Patienten
Zusätzliche Verdünnungsfaktoren (bei Verwendung einer
unterschiedliche organische Erkrankungen festgestellt
anderen Verdünnung als 1:2500) müssen für den Erhalt der
wurden (Kolitis, Crohn’s, Ulzera, Divertikulitis, Polypen,
endgültigen Ergebnisse mit den Ergebnissen multipliziert
Adenome, Karzinome oder Infektionserkrankungen) (Ref.
werden.
5).
In der Tabelle 7 und Abbildung 1 werden Beispiele für Die ROC Analyse (AUC: 0,962) ergab einen optimalen
Ergebnisse und die Standardkurve gezeigt. Diese klinischen Grenzwert von 50 μg/g für die Differenzierung
Ergebnisse und die Standardkurve sind nur als Beispiel zwischen organischen und funktionellen Erkrankungen mit
gedacht. Sie müssen für jeden Ansatz eine Standardkurve einer klinischen Spezifität von 88,8 % und einer Sensitivität
ansetzen. von 93,6 % (Tabelle 4).
Messbereich 30-1800 µg/g Calprotectinwerte von Erwachsenen und Kindern zwischen
Wenn Sie die „Extended Range“ ELISA Variante 4 und 17 Jahren sind vergleichbar, während die Werte von
verwenden, müssen die folgenden nominalen Neugeborenen signifikant höher sind (Ref. 8).
Kalibratorwerte eingestellt werden: 30, 90, 300, 900 und Diese Daten stützen die folgenden Empfehlungen zur
1800 µg/g Calprotectin. Zusätzliche Verdünnungsfaktoren Beurteilung der Ergebnisse:
(bei Verwendung einer anderen Verdünnung als 1:7500)
müssen für den Erhalt der endgültigen Ergebnisse mit den
Ergebnissen multipliziert werden.
Revision date: 2018-04-10 13/52 BÜHLMANN fCAL® ELISAWerte unter 50 µg/g:
Werte oberhalb von 300 µg/g:
Calprotectinwerte unter 50 µg/g schliessen eine Ent-
Messungen von fäkalen Calprotectinkonzentrationen
zündung des gastrointestinalen Traktes weitgehend aus.
oberhalb von 300 µg/g sollten wiederholt werden. Falls die
Patienten mit niedrigen Calprotectinkonzentrationen
erhöhten Werte bestätigt werden, sollten unverzüglich
benötigen vermutlich keine invasiven Untersuchungen, um
weitere Untersuchungen erfolgen (Ref. 10-20).
die Entzündungsursache zu bestimmen (Ref. 4).
Die oben genannten Ergebniskategorien sind als
Erhöhte Werte zwischen 50 und 200 µg/g: Empfehlungen zu betrachten. Es wird empfohlen, dass
Calprotectinwerte zwischen 50 und 200 µg/g können durch Ärzte die Grenzwerte für den einzelnen Patienten festlegen,
eine milde Form der organischen Erkrankung wie z.B. eine indem Sie den Ausgangswert für Calprotectin während der
durch NSAIDs verursachte Entzündung, eine milde Form Remission bestimmen.
der Divertikulitis und durch IBD in einer Remissionsphase Ein falsch-negatives Resultat bei einen Patienten mit einer
verursacht werden. Da eine geringe Entzündungsaktivität endoskopisch nachweisbaren Entzündung, das ein
vorhanden ist, empfehlen sich eine Wiederholungs- Calprotectinergebnis in der Kategorie mit Werten unter
messung und weitere Untersuchungen. 100 µg/g anzeigt, aber einen Wert oberhalb von 300 µg/g
Erhöhte Werte oberhalb von 200 µg/g: zeigen sollte, kann - obwohl unwahrscheinlich - geeignete
Calprotectinwerte oberhalb von 200 µg/g deuten auf eine klinische Entscheidungen und die Behandlung des
aktive Form einer organischen Erkrankung des gastro- Patienten verzögern. Daher ist es wichtig, dass der Patient
intestinalen Traktes hin. Es werden entsprechende weitere weiterhin von einem Arzt betreut wird und mögliche
Untersuchungen durch Spezialisten empfohlen. klinische Symptome meldet. Studien haben gezeigt, dass
hohe Calprotectinwerte, oberhalb von 300 µg/g, nicht immer
Der für Erwachsene empfohlene Cut-off Wert von 50 µg/g auf die Entwicklung eines klinischen Rückfalls hindeuten
kann auch für Kinder zwischen 4 und 17 Jahren verwendet (Ref. 10-20). Hohe Calprotectinwerte müssen als
werden, unabhängig von deren Geschlecht (Ref. 8-9). Warnsignal betrachtet und die Messung muss wiederholt
werden. Bei einer Bestätigung erhöhter Werte sind
unverzüglich weitere Untersuchungen vorzunehmen.
INTERPRETATION DER ERGEBNISSE
IBD-ÜBERWACHUNG LEISTUNGSMERKMALE
Die Bestimmung von fäkalem Calprotectin ist auch eine Messbereich: 10-600 µg/g
zuverlässige und einfache Methode, um die Überwachung Recovery: 1,8-5,9 % CV
von IBD-Patienten zu unterstützen (Ref. 10-20).
Intra-Assay Präzision: 5,3 %-10,0 % CV
Die Korrelation der Calprotectinkonzentrationen und dem
Entzündungsstatus der Darmschleimhaut von Patienten mit Wiederholbarkeit und Intra-Assay Präzision wurden gemäß
endoskopischen Bewertungen wurde in drei voneinander der CLSI Richtlinie EP5-A2 bestimmt. Neun extrahierte
unabhängigen Studien mit den BÜHLMANN Calprotectin- Stuhlproben wurden entsprechend der Arbeitsanleitung
tests (Tabelle 5) ermittelt. über einen Zeitraum von 20 Tagen in Duplikaten geprüft.
Der diagnostische Wert von Calprotectin zur Vorhersage Pro Tag wurde ein Testlauf durchgeführt. Die Werte sind in
einer klinischen Remission und eines Rückfalls anhand von Tabelle 8 dargestellt.
Symptomen des Patienten, Anzeichen einer klinischen Limit of Blank (LoB):Funktionelle Empfindlichkeit:
Réactifs Quantité Code Reconstitution
FRANCAIS tampon protéique
avec conservateurs
Contrôles bas et
UTILISATION PREVUE élevé3) 2 flacons de B-CAL-
Prêts à l’emploi
Sérum humain avec 1 mL CONSET
Le test BÜHLMANN fCAL® ELISA est un test diagnostique
conservateurs
in vitro de dosage quantitatif de la calprotectine dans les
Marqueur
échantillons de selles humaines. Son but est d'aider à enzymatique 2 flacons de
évaluer l'état inflammatoire de la muqueuse intestinale. Les B-CAL-EL Prêt à l’emploi
Ac anti-calprotectine 12 mL
résultats de l'essai peuvent contribuer, d'une part, au conjugué à la HRP
diagnostic permettant de distinguer – chez les patients de Substrat TMB
2 flacons de
plus de quatre ans souffrant de douleurs abdominales Solution de TMB dans B-TMB12 Prêt à l’emploi
12 mL
chroniques (réf. 8-9) – une maladie inflammatoire du tractus un tampon citrate
gastro-intestinal de type organique (maladie inflammatoire Solution stop Prête à l’emploi
2 flacons de 12 mL B-STS12
0.25 M H2SO4 corrosif
chronique de l’intestin MICI, par ex. maladie de Crohn ou
Tableau 1
recto-colite hémorragique, RCH) d'une maladie
1)
fonctionnelle (syndrome de l’intestin irritable, SII) (réf. 1-7) Les concentrations actuelles de calprotectine des calibrateurs A à E sont
et, d'autre part, au suivi d’une MICI (réf. 10-20). respectivement : 4, 12, 40, 120 et 240 ng/mL. Après extraction et dilution
de l’échantillon, une dilution à 1:2500 est prise en compte pour la
détermination des calibrateurs A à E. Dans le cas de la procédure ELISA
Pour utilisation en laboratoire uniquement. sur la gamme la plus basse, les valeurs des calibrateurs doivent être les
suivantes : 10, 30, 100, 300 et 600 µg/g de calprotectine.
2)
Si l’utilisateur choisit la procédure ELISA sur la gamme étendue, les
PRINCIPE DU TEST valeurs nominales des calibrateurs doivent être les suivantes : 30, 90,
La trousse BÜHLMANN fCAL® ELISA permet de mesurer 300, 900 et 1 800 µg/g de calprotectine.
3)
Les concentrations en calprotectine humaine native des contrôles varient
de façon sélective la calprotectine dans des extraits fécaux en fonction des lots. Veuillez-vous référer à la fiche de contrôle qualité
au moyen d'un dosage ELISA de type sandwich. La pour les concentrations effectives.
microplaque du test BÜHLMANN fCAL® ELISA est
recouverte à l'aide d'un anticorps de capture monoclonal STOCKAGE ET DUREE DE CONSERVATION
(Acm) hautement spécifique vis-à-vis des complexes DES REACTIFS
hétérodimères et polymères de calprotectine. On dépose
Réactifs non ouverts/ non entamés
sur les puits de la microplaque les extraits d'échantillons
fécaux du patient, les témoins permettant de déterminer Stables à 2-8 °C. Ne pas utiliser au-delà de la date de péremption
figurant sur les étiquettes.
l'acceptabilité du dosage ELISA ainsi que des calibrateurs.
Réactifs ouverts/ reconstitués
À l'issue d'une incubation de 30 minutes à température
ambiante et d'étapes de lavage, un anticorps (Ac) de Tampon d’extraction Stables à 2-8 °C jusqu’à la date de péremption
détection conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) met en Replacer immédiatement les barrettes non
utilisées dans la pochette contenant le
évidence les molécules de calprotectine liées à l'anticorps Microplaque
dessiccateur puis la refermer soigneusement.
de capture sur la microplaque. Après l'incubation et d'autres Stable à 2-8 °C jusqu’à la date de péremption.
étapes de lavage, on ajoute le substrat chromogène de la Tampon de lavage Stable à 2-8 °C pendant 6 mois après dilution
HRP, la tétraméthylbenzidine (TMB) (formation d'une
Tampon d’incubation
coloration bleue) puis une solution qui arrête la réaction (la
coloration vire au jaune). On mesure l'absorption à 450 nm. Calibrateurs
À partir de la courbe d’étalonnage établie avec les valeurs Contrôles
de mesure des calibrateurs, on détermine la concentration Marqueur
Stables à 2-8 °C jusqu’à la date de péremption
finale de calprotectine, en µg/g de selles, dans les enzymatique
échantillons du patient. Substrat TMB
Solution stop
REACTIFS FOURNIS ET PREPARATION Stop Solution
Réactifs Quantité Code Reconstitution Tableau 2
Microplaque
Coatée avec un Acm 2 x 12 x 8 puits B-CAL-MP Prête à l’emploi REACTIFS ET MATERIELFOURNIS SELON LA
anti- calprotectine DEMANDE
Films adhésifs 6 pièces - Prête à l’emploi Tubes d’extraction de selles
A reconstituer Les tubes d'extraction de selles décrits ci-après ne sont pas
Tampon de lavage
2 flacons de avec 900 mL
concentré 10x B-CAL-WB inclus dans le kit. Ils peuvent être commandés séparément.
100 mL d’eau déionisée
Avec conservateurs
(chacun)
Tubes d'extraction Quantité Code
Tampon
3 flacons de 50, 200 ou 500 dispositifs B-CALEX-C50
d’incubation B-CAL-IB Prêt à l’emploi
125 mL pré-remplis avec 5 mL de
Avec conservateurs ®
CALEX Cap B-CALEX-C200
tampon d’extraction / prêts
Calibrateurs A-E1) 2) B-CAL- B-CALEX-C500
5 flacons de 1 mL Prêts à l’emploi à l’emploi
Calprotectine dans un CASET
Revision date: 2018-04-10 16/52 BÜHLMANN fCAL® ELISATableau 3
Précautions techniques
MATERIEL REQUIS MAIS NON FOURNI Composants du kit
• Les puits de la microplaque peuvent être recouverts de
Procédure d’extraction
résidus formés lors du processus de production. Ils sont
• Anses d’inoculation jetables de 10 µL éliminés par le lavage (voir l'étape 3 de la procédure) et
• Tubes de 15 mL en polypropylène avec bouchons à n'ont aucune influence sur les résultats.
visser pour la procédure d’extraction standard ou tubes • Lire attentivement les instructions avant de réaliser le
d’extraction (voir ci-dessus) test. Le test ne donnera pas les résultats escomptés en
• Hotte à flux laminaire cas de dilution incorrecte ou de modification des réactifs,
• Agitateur Multi- tubes ou vortex ou de stockage dans des conditions autres que celles
détaillées dans le présent mode d’emploi.
• Balance de précision (10-150 mg)
• Les composants ne doivent pas être utilisés au-delà de
• Micro centrifugeuse (≥3000 x g) la date d'expiration imprimée sur les étiquettes.
• Centrifugeuse (≥500 x g) • Ne pas mélanger des réactifs de lots différents.
Procédure de l’ELISA • Il convient de prendre toutes les précautions requises
• Pipettes de précision réglables avec pointes jetables pour empêcher toute contamination croisée entre
pour 10, 100 et 1000 µL réactifs, entre échantillons ou entre puits.
• Tubes jetables en polypropylène ou polystyrène pour la • Laisser les réactifs s’équilibrer à température ambiante.
préparation des dilutions d’échantillons Reconstituer les réactifs lyophilisés comme
• Eprouvette graduée de 1000 mL pour la préparation du indiqué. Bien mélanger (au vortex) les réactifs avant
tampon de lavage utilisation.
• Laveur automatique de microplaques ou une pissette • Les puits de la microplaque sont à usage unique.
pour le tampon de lavage (voir précautions techniques) Extraction
• Papier absorbant • Afin d’obtenir des résultats quantitatifs, il est important
• Agitateur de microplaques (voir précautions techniques) d’homogénéiser l’échantillon de selle en totalité dans le
dispositif d’extraction. Les substances non dissoutes
• Lecteur de microplaques pour la mesure de
(non digérées) peuvent persister dans les tubes après
l’absorbance à 450 nm
l’extraction.
PRECAUTIONS Procédure de l’ELISA
• Le lavage est un point important de l’ELISA. Pour
Précautions de sécurité
garantir la reproductibilité des résultats il est nécessaire
• Les calibrateurs et les contrôles de cette trousse que le tampon de lavage incube à chaque fois au
contiennent des composants d’origine humaine. Bien minimum 20 secondes dans les puits de la plaque.
que les tests de détection de l’antigène de surface du
• Les laboratoires BÜHLMANN recommandent, lors de
VHB et des anticorps des virus VHC et VIH1/2 se soient
l’utilisation d’un laveur de plaque automatique, le choix
révélés négatifs, il convient de considérer les réactifs
du mode “Plaque” avec lequel chaque étape
comme capables de transmettre des maladies
(remplissage/aspiration) est effectuée de facon
infectieuses, et de les manipuler conformément aux
séquentielle par barrette avant de passer à l’étape
bonnes pratiques de laboratoire (BPL), en prenant les
suivante. De cette façon le temps d’incubation minimum
précautions appropriées.
est garanti.
• Solution Stop: La Solution stop (B-STS12) contient de
• Il est obligatoire de respecter le nombre de cycles de
l'acide sulfurique (0,25 M). Le réactif est irritant pour les
lavage pour l’obtention de résultats fiables.
yeux, la peau et les membranes muqueuses. Éviter le
contact avec les yeux, la peau et les vêtements. En cas • L’agitateur de plaque doit être réglé à 450 rpm (You can also read
