Anti-SGPG Autoantibodies - ELISA SGPG: Sulfate-3-Glucuronyl Paragloboside - BÜHLMANN Laboratories ...
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anti-SGPG Autoantibodies
ELISA
SGPG: Sulfate-3-Glucuronyl Paragloboside
EK-SGPG 96 tests
Release Date: 2020-07-16
Version A2
BÜHLMANN LABORATORIES AG English page 3
Baselstrasse 55 Deutsch Seite 7
4124 Schönenbuch, Switzerland Français page 11
Tel.: +41 61 487 1212 Italiano pagina 15
Fax: +41 61 487 1234 Espanõl pàgina 19
info@buhlmannlabs.ch Português pàgina 23Release date: 2020-07-16 2/32 anti-SGPG Autoantibodies ELISA
ENGLISH
Reagents Quantity Code Reconstitution
INTENDED USE
TMB Substrate 1 vial
B-TMB Ready to use
The BÜHLMANN anti-SGPG Autoantibodies ELISA is TMB in citrate buffer 11 mL
intended for the semi-quantitative in vitro diagnostic Ready to use
Stop Solution 1 vial
determination of human IgM-auto-antibodies directed B-STS Corrosive
against sulfate-3-glucuronyl paragloboside [SGPG] and 0.25 M sulfuric acid 11 mL
agent
sulfate-3-glucuronyl-lactosaminyl-paragloboside [SGLPG]. Table 1
The test serves as an aid to diagnosis of Paraproteinemic 1) The calibrator consists of a diluted positive serum which has been
Demyelinating Neuropathy (PDN) in conjunction with standardized to an internal established reference (see chapter
other clinical and laboratory findings (1-6). standardization and cut-off).
2)
Controls low, medium and high contain lot-specific amounts of anti-
SGPG antibodies. Refer to the QC data sheet provided with the kit for
PRINCIPLE OF THE ASSAY the appropriate ratios.
The anti-SGPG Autoantibodies ELISA employs the
enzymatically amplified sandwich-type immunoassay STORAGE AND SHELF LIFE OF REAGENTS
technique. The microtiter plates of the test are precoated Sealed / Unopened Reagents
with highly purified SGPG and SGLPG from bovine cauda
All sealed/unopened kit components are stable at 2-8 °C until the
equina. Calibrator, controls, and patient sera are expiration date printed on the labels.
incubated in the microtiter wells and anti-SGPG auto- Opened / Reconstituted Reagents
antibodies present in the samples bind to the immobilized Return unused strips immediately to the
SGPG/ SGLPG. After washing off of unbound substances, aluminium pouch containing the desiccant packs
Microtiter Plate
the anti-SGPG auto-antibodies are detected with and reseal along the entire edge of zip-seal.
horseradish-peroxidase (HRP) labelled antibodies against Store for up to 2 months at 2-8 °C.
human IgM. Following a second washing step, in which Diluted Wash Buffer Store for up to 2 months at 2-8 °C.
unbound enzyme label is removed, a substrate solution Calibrator
Store for up to 2 month at -20 °C.
containing tetramethylbenzidine (TMB) is added. A blue Controls
colour develops in proportion to the amount of anti-SGPG
Incubation Buffer
auto-antibodies bound to the immobilized SGPG and Store at 2-8 °C until expiration date printed on
SGLPG. Colour development is stopped by adding an Enzyme Label the labels.
acidic stop solution (diluted sulphuric acid) which turns the TMB Substrate
blue solution into yellow. The intensity of the colour is Store at 18-28 °C until expiration date printed on
Stop Solution
the labels.
measured at 450 nm.
Table 2
The measured absorbance is proportional to the titre of
auto-antibodies present in a given sample. The titers of
anti-human SGPG auto-antibodies are expressed as
MATERIALS REQUIRED BUT NOT PROVIDED
ratios of the calibrator and can be assigned to titer • Precision pipettes with disposable tips capable of
categories. pipetting the following volumes: 2 µL, 100 µL and
1000 µL.
REAGENTS SUPPLIED AND PREPARATION • Disposable polystyrene or polypropylene tubes for the
Reagents Quantity Code Reconstitution preparation of sample dilutions.
Microtiter Plate • 1000 mL cylinder for the dilution of the wash buffer.
Precoated with 12 x 8-wells B-SGPG-MP Ready to use • Squeeze bottle for wash buffer or automatic microtiter
bovine SGPG plate washer.
Plate Sealer 3 pieces
• Blotting paper.
Wash Buffer Dilute with
Concentrate (10x)
1 bottle • Orbital shaker for microtiter plates.
B-MAG-WB 900 mL of
100 mL deionized water • Microtiter plate reader for measurement of absorbance
With preservatives
1 bottle at 450 nm.
Incubation Buffer
B-MAG-IB Ready to use
With preservatives 100 mL
Calibrator1 Add 1 mL of
PRECAUTIONS
Human serum with 1 vial B-SGPG-CA Incubation Safety precautions
preservatives Buffer
• Both, calibrator (B-SGPG-CA) and controls (B-SGPG-
Control Low,
Add 1 mL of CONSET) of this kit contain components of human
Medium and High2 B-SGPG-
3 vials
CONSET
Incubation origin. Although tested and found negative for HBV
Human serum with Buffer
preservatives surface antigen, HCV and HIV1/2 antibodies, the
Enzyme Label IgM reagents should be handled as if capable of
Anti-human IgM Ab
transmitting infections and should be handled in
conjugated to HRP in 1 vial B-SGPG-ELM
Ready to use accordance with good laboratory practices using
a protein-based 11 mL Blue solution appropriate precautions.
buffer with
preservatives
Release date: 2020-07-16 3/32 anti-SGPG Autoantibodies ELISA• Stop solution: The stop solution (B-STS) contains • Lipemic, hemolytic and icteric samples should not be
sulfuric acid (0.25 M). The reagent is an irritant to used in this assay. Lipemic samples can be avoided by
eyes, skin and mucous membranes. Avoid contact with asking patients to fast for at least 12 hours prior to the
eyes, skin and clothes. After contact with eyes or skin, sample being taken.
wash immediately with plenty of water. • Collect blood into plain tubes (no anti-coagulant), avoid
• Reagents: Avoid contact of reagents with the skin, haemolysis, leave to clot for one hour at room
eyes, or mucous membranes. If contact does occur, temperature (18-28 °C), centrifuge for 10-30 minutes
immediately wash with generous amounts of water; at 1000-2000 x g, collect the serum.
otherwise, irritation / burns can occur. • Store serum samples at ≤ -20 °C. Samples are stable
• Unused solution should be disposed of according to for ≥1 year if stored at ≤ -20 °C. Avoid repeated freeze-
local state and federal regulations. thaw cycles. Frozen samples should be thawed and
mixed thoroughly by gentle swirling or inversion prior
Technical precautions
to use.
• Read carefully the instructions prior to carrying out the
test. Test performance will be adversely affected, if • We recommend freezing aliquots of patient samples in
reagents are incorrectly diluted, modified or stored order to avoid repeated freezing / thawing.
under conditions other than those as detailed in this
instruction for use. ASSAY PROCEDURE
• Residues in the microtiter plate wells result from the 1. Dilute all patient samples to be investigated 1:1000
production process. They are removed in the washing with incubation buffer. Use e.g. 2 µL of
step (assay procedure step 3) and do not affect the serum + 2000 µL of incubation buffer. Mix thoroughly
results. by vortexing and leave diluted samples for one hour at
18-28°C. Put samples as well as reconstituted
• Prepare reagents before starting the assay procedure.
calibrators and controls for 10 minutes on ice prior to
Reagents used in steps 3-9 must be cold
pipetting in step 4.
(2-8 ˚C) and kept cold while pipetting and washing. Put
the TMB substrate at room temperature (18-28 ˚C). 2. Prepare a plate-frame with the required number of
strips to test the calibrators, controls and patient
• Steps 3-9: Use cold (2-8 °C) reagents for all these
samples. Reseal the remaining strips in the foil pouch
steps and keep them cold while pipetting.
together with the desiccant packs immediately. Store
Recommendation: Prepare the wash buffer the
refrigerated.
evening before performing the assay and place it into
the fridge overnight. Note: Use cold reagents in steps 3 to 9.
• Wash steps 3, 6 and 9: The wash steps are crucial for 3. Wash coated wells four times using at least 300 µL of
removing residues in the microtiter plate wells resulting cold! wash buffer per well. Empty wells and tap plate
from the production process (step 3) as well as any firmly onto blotting paper to remove remaining liquid
unbound auto-antibodies (steps 6 and 9). completely.
→ Always perform the wash steps with cold (2-8 ˚C) 4a. Pipet 100 µL of incubation buffer (blank) in duplicate
wash buffer. into wells A1+A2.
→ Make sure that all wells are completely empty after 4b.Pipet 100 µL of calibrator in duplicate into wells B1+B2
the last washing cycle. 4c.Pipet 100 µL of control low in duplicate into wells
• Step 10: Adjust TMB substrate to room temperature C1+C2
(18-28 °C) before using it. 4d. Pipet 100 µL of control medium in duplicate into wells
• Step 11: Shake the microtiter plates during the D1+D2
incubation with substrate. Depending on the plate 4e. Pipet 100 µL of control high in duplicate into wells
shaker, we recommend 400-600 rpm. The solution E1+E2
should move in the wells but must not spill over. 4f. Pipet 100 µL of each diluted sample in duplicate into
• If an automated washer is used, “plate mode” should the subsequent wells.
be chosen so that dispensing is performed sequentially 5. Cover the plate with a plate sealer and incubate for 2
on all strips before aspirating. hours (± 5 min) at 2-8 °C.
• Components must not be used after the expiry date 6. Remove plate sealer. Empty the wells and wash four
printed on the labels. times using at least 300 µL of cold wash buffer (2-
• Do not mix different lots of reagents. 8 °C) per well. Empty the wells and strike the plate
• Every effort should be made to ensure that no cross firmly onto blotting paper in order to remove washing
contamination occurs between reagents, samples or buffer completely.
between wells. 7. Add 100 µL of enzyme label IgM to all wells.
• Microwells cannot be re-used. 8. Cover plate with a plate sealer, and incubate for 2
hours (± 5 min) at 2-8 °C.
SPECIMEN COLLECTION AND STORAGE 9. Remove plate sealer. Empty the wells and wash four
times using at least 300 µL of cold wash buffer (2-
• The procedure requiresfirmly onto blotting paper in order to remove wash Note: Results presented in table 3 are examples.
buffer completely. Calibrator and controls must be used in each individual
Note: Adjust TMB substrate solution to room temperature assay.
(18-28 °C).
10. Add 100 µL of TMB substrate solution to each well. LIMITATIONS
11. Cover plate with a plate sealer, incubate plate on an 1. Test results should be interpreted in conjunction with
orbital plate shaker at 400-600 rpm for 30 ± 2 minutes information available from clinical assessment of the
at 18-28 °C. Protect the plate from direct light. patient and other diagnostic procedures.
12. Add 100 µL of stop solution to all wells. Proceed to 2. The anti-SGPG Autoantibodies ELISA has not been
step 13 within 30 minutes. validated for plasmapheresis samples.
13. Read absorbance at 450 nm in a microtiter plate
reader. REFERENCE INTERVALS AND CUT-OFF
Proposed cut-off ratio
QUALITY CONTROL
The background ratio of anti-SGPG was determined using
A good understanding of this instruction for use is 200 blood samples from asymptomatic volunteer blood
necessary to obtain reliable results. These will be donors (49 female, 151 male at the age of 18 to 70 years)
obtained only by using precise laboratory techniques which were tested according to the assay procedure. Only
(current GLP guidelines) and accurately following the 1/200 (0.5 %) samples showed a ratio of >1. Six sera
instruction for use. showed a ratio between 0.5 and 0.6, whereas 193/200
BÜHLMANN strongly recommends testing blank, (96.5 %) sera showed ratio values below 0.5.
calibrator, control and samples in duplicate. 14 anti-MAG positive sera were tested. Each serum
Since there is no control serum for anti-SGPG auto- showed a ratio of 2.4 or higher. The results are listed in
antibodies commercially available, we recommend using a table 4. We propose a cut-off ratio of 1.
positive, and negative serum pool for internal quality Additionally, in an external study including 223 sera from
control. patients affected by a suspected neuropathy the above
All controls must be within established confidence ranges. proposed cut-off was verified. 178 sera were tested with
The confidence ranges of the controls are lot-specific and the reference method thin layer chromatography (TLC)
printed on the QC data sheet delivered with this kit. described in the literature (4). 99/110 positive TLC sera
Performance characteristics should be within established were tested positive in the anti-SGPG Autoantibodies
limits. If these characteristics are not in conformity with ELISA. 66/68 TLC negative sera were tested negative in
established limits and repetition excludes handling the ELISA. This results in a calculated sensitivity and
failures, check the following issues: i) Have all reagents, specificity of the ELISA of 90.0 % and 97.1 %,
used in step 3-10, been kept at 2-8 °C? ii) accuracy of respectively (personal communication Dr. C. Caudie,
pipets, thermometers, and timers, iii) settings of ELISA Lyon, F.).
washer and reader, iv) expiration date of the reagents v)
storage and incubation conditions vi) colour of the TMB PERFORMANCE CHARACTERISTICS
substrate solution (should be colourless) vii) purity of the
water. Intra-Assay Precision (Within-Run): 4.9%. The intra-
assay precision was calculated from results of 20 pairs of
STANDARDIZATION values from four human sera obtained in a single run
(table 5).
The calibrators included in this kit have been standardized
Inter-Assay Precision (Run-to-Run): 10.0%. The inter-
against an internal reference material (diluted positive
assay precision was calculated from the results of 20
serum). The dilution was chosen in the range between the
pairs of values from six human sera obtained in 20
OD of normal blood donors and positive sera.
different runs (table 6).
Dilution Linearity/Parallelism: 154%. 13 human serum
RESULTS AND CALCULATION
samples containing high titer of anti-SGPG antibodies
Calibrator: Record absorbance at 450 nm (OD450) and were diluted with incubation buffer 1:1000 to 1:128’000,
subtract the averaged blank value. Average the duplicate left for one hour at 18-28 °C and subsequently assayed
values. The ratio of the calibrator is set to a value of 1 according to the assay procedure. The O/E ratio
(divided by itself). (observed/expected) was calculated step by step (table
Samples and controls: Record absorbance at 450 nm 7). It is suggested that the relatively high deviation
(OD450) for each sample and control well and subtract the particularly at high antibody titers in the samples is due to
averaged blank value. Average the duplicate values. antibody aggregations. In general, pathological sera show
Calculate ratio from the averaged sample absorbance to strongly elevated antibody titers therefore it has no
the averaged absorbance of the calibrator. influence to the positive/negative discrimination.
Detection Limit (LoB) :Detection Limit (LoQ) :
DEUTSCH
Reagenz Inhalt Art.-Nr. Rekonstitution
ANWENDUNGSZWECK Enzym-Marker IgM
Anti-human-IgM
Der BÜHLMANN anti-SGPG Autoantikörper ELISA ist für Antikörper, an HRP 1 Flasche Gebrauchsfertig
B-SGPG-
die halbquantitative in vitro Diagnose von human-IgM konjugiert, in einem ELM
11 mL Blaue Lösung
Autoantikörper vorgesehen, die gegen Sulfat-3- Puffer auf Proteinbasis
glucuronylparaglobosid [SGPG] und Sulfat-3-glucuronyl- mit Konservierungs-
mitteln
lactosaminyl-paraglobosid [SGLPG] gerichtet sind. Dieser
TMB Substrat 1 Flasche
Test unterstützt in Verbindung mit anderen klinischen B-TMB Gebrauchsfertig
Ergebnissen und Laborergebnissen die Diagnose einer In Citratpuffer 11 mL
paraproteinämischen, demyelisierenden Neuropatie Stopp Lösung 1 Flasche Gebrauchsfertig
B- STS
(PDN) (1-6). 0,25 M H2SO4 11 mL Korrosiv!
Tabelle 1
PRINZIP DER METHODE 1) Der Kalibrator besteht aus verdünntem, positivem Serum, welches
gegen eine intern etablierte Referenz, standardisiert wurde (siehe
Der anti-SGPG Autoantikörper ELISA verwendet die
Kapitel Standardisierung und Grenzwert).
enzymatisch amplifizierte Immunoassay-Technik vom 2)
Die Kontrollen enthalten Lot-abhängige anti-SGPG Antikörper
Sandwichtyp. Die Mikrotiterplatten des Tests werden mit Mengen. Für Konzentrationsangaben siehe beigelegtes
hochreinem SGPG und SGLPG von bovinem cauda Kontrolldatenblatt.
equina vorbeschichtet. Kalibrator, Kontrollen und
Patientenseren werden in den Wells der Mikrotiterplatte LAGERUNG UND HALTBARKEIT DER
inkubiert und alle in der Probe vorliegenden anti-SGPG- REAGENZIEN
Autoantikörper binden an immobilisiertes SGPG/ SGLPG.
Verschlossene/ Ungeöffnete Reagenzien
Nach dem Abwaschen der nichtgebundenen Substanzen,
werden die anti-SGPG Autoantikörper mit HRP- Alle verschlossenen/nicht geöffneten Kitkomponenten sind bei 2-8 °C
bis zu dem auf den Etiketten aufgedruckten Verfallsdatum stabil.
konjugierten Antikörpern nachgewiesen, die gegen
humanes IgM gerichtet sind. Nach einem zweiten Geöffnete /Rekonstituierte Reagenzien
Waschschritt, bei dem die ungebundenen Ungebrauchte Streifen sofort in die mit
Enzymkonjugat-Antikörper entfernt werden, wird eine Dessikator versetzte Aluminiumverpackung
Mikrotiter-Platte
Substratlösung, die Tetramethylbenzidin (TMB) enthält, zurückbringen. Packung völlig schliessen. Bis zu
2 Monate bei 2-8 °C haltbar.
zugegeben. Die blaue Farbe entwickelt sich proportional
zur Menge der SGPG-Autoantikörper, die an Wasch-Puffer Zu verwenden bis 2 Monate nach Rekonstitution.
immobilisiertes SGPG und SGLPG gebunden sind. Die (verdünnt) Bei 2-8 °C lagern.
Farbentwicklung wird durch Zugabe einer sauren Kalibrator Zu verwenden bis 2 Monate nach Rekonstitution.
Stopplösung beendet (verdünnte Schwefelsäure) und Kontrollen Bei -20 °C lagern.
bewirkt einen Farbumschlag von blau zu gelb. Die
Inkubations-Puffer
Intensität der Farbe wird bei 450 nm gemessen. Die Bis zum auf den Etiketten aufgedruckten
gemessene Absorption ist proportional zum Titer der Enzymmarker IgM
Verfallsdatum bei 2-8 °C lagern.
Autoantikörper, die in der jeweiligen Probe vorhanden TMB Substrat
sind. Die Titer von anti-human SGPG werden als Bis zum auf den Etiketten aufgedruckten
Stopp-Lösung
Verhältnisse des Kalibrators angegeben und können den Verfallsdatum bei 18-28 °C lagern
Titerkategorien zugeordnet werden. Tabelle 2
GELIEFERTE REAGENZIEN UND VORBEREITUNG ERFORDERLICHE LABORGERÄTE UND
HILFSMITTEL
Reagenz Inhalt Art.-Nr. Rekonstitution
Mikrotiter-Platte • Präzisionspipetten mit Einwegspitzen welche folgende
12 x 8
Küvetten mit
B-SGPG-
Gebrauchsfertig Volumina pipettieren können; 2 µL, 100 µL und
Beschichtet mit SGPG MP
(bovin) Halter 1000 µL.
Abdeckfolien 3 Stück • Polystyren oder Polypropylen Einwegröhrchen zur
Wasch-Puffer Vorbereitung der Verdünnungsproben.
Konzentrat (10x) 1 Flasche Mit 900 mL
B-MAG-
deionisiertem H2O
• 1000 mL Zylinder zur Verdünnung des Waschpuffers.
Mit 100 mL WB
verdünnen • Spritzflasche für Waschpuffer oder automatischer
Konservierungsstoffen
Mikrotiterplattenwascher.
Inkubations-Puffer
1 Flasche • Saugfähiges Papier.
Mit B-MAG-IB Gebrauchsfertig
100 mL
Konservierungsstoffen • Orbitalschüttler für Mikrotiterplatten.
Kalibrator1 Mit 1 mL • Microtiter-Platten-Photometer mit optischem Filter
B-SGPG-
Humanes Serum mit 1 Flasche Inkubations-Puffer (450 nm).
CA
Konservierungsstoffen versetzen
Kontrolle tief,
medium und hoch2 Mit 1 mL
B-SGPG-
3 Flaschen Inkubations-Puffer
Humanes Serum mit CONSET
versetzen
Konservierungsstoffen
Release date: 2020-07-16 7/32 anti-SGPG Autoantibodies ELISAVORSICHTSMASSAHMEN Bewegung gebracht werden, darf aber nicht
überschwappen.
Sicherheitsmassnahmen
• Wird ein Waschautomat eingesetzt, soll der
• Kalibrator (B-SGPG-CA) und Kontrollen (B-SGPG-
sogenannte „Platten-Modus“ gewählt werden. Das
CONSET) enthalten Komponenten humaner Herkunft.
heisst, dass das Einfüllen des Waschpuffers erst über
Bestandteile humanen Ursprungs. Obwohl sie negativ
die gesamte Platte ausgeführt wird, bevor das
in Tests für HBV Oberflächenantigen, HCV und HIV1/2
Absaugen gestartet wird.
Antikörper waren, sollten gemäss Good Laboratory
Practice als potentiell infektiös behandelt werden und • Die Reagenzien dürfen nach Ablauf des
die entsprechenden Sicherheitsvorkehrungen getroffen Verfallsdatums nicht mehr verwendet werden.
werden. • Mischen Sie nicht Reagenzien verschiedener Kit Lots.
• Stopp-Lösung: Die Stopp-Lösung (B-BTS) enthält • Vermeiden Sie unter allen Umständen, dass es zu
Schwefelsäure (0,25 M). Das Reagenz reizt die einer Kontamination zwischen verschiedenen
Augen, Haut und Schleimhäute. Berührung mit Augen, Reagenzien, Proben und zwischen den Wells kommt.
Haut und Kleidung vermeiden. Nach Berührung mit • Mikrotiterstreifen dürfen nicht wiederverwendet
den Augen oder der Haut, sofort mit reichlich Wasser werden.
waschen.
• Reagenzien: Kontakt der Reagenzien mit der Haut, UNTERSUCHUNGSMATERIAL UND LAGERUNG
den Augen oder Schleimhäuten vermeiden. Bei
Berührung, sofort mit reichlich Wasser waschen; • Dieser Test benötigtsorgfältig trocknen, um die Flüssigkeit vollständig zu Eichung, iv) Verfallsdaten der Reagenzien, v) Lagerung-
entfernen. und Inkubations-Bedingungen, vi) die TMB
4a.Je 100 µL Inkubations-Puffer in die Wells A1 und A2 Substratlösung sollte farblos sein, vii) Wasserreinheit.
pipettieren (Blank).
4b.Je 100 µL Kalibrator in B1+B2 pipettieren. STANDARDISIERUNG
4c.Je 100 µL Kontrolle tief in C1+C2 pipettieren. Der Kalibrator des BÜHLMANN anti-SGPG ELISA Kits
4d. Je 100 µL Kontrolle medium in D1+D2 pipettieren. wurde an einer internen Referenz standardisiert. Die
Referenz besteht aus einem verdünnten positiven Serum.
4e.Je 100 µL Kontrolle hoch in E1+E2 pipettieren.
Die Verdünnung wurde so gewählt dass die resultierende
4f.Je 100 µL der verdünnten Proben im Doppel in die OD im Bereich zwischen normalen und positiven Seren
nachfolgenden Wells pipettieren. liegt.
5. Mikrotiter-Platte mit einer Abdeckfolie abdecken und
2 Stunden (±5 Minuten) bei 2-8 °C inkubieren. BERECHNUNG DER ERGEBNISSE
6. Abdeckfolie entfernen. Die Wells entleeren und vier Kalibrator: Absorption des Kalibrators bei 450 nm ablesen
Mal mit jeweils mindestens 300 µL kaltem Waschpuffer und den gemittelten Blank Wert abziehen. Mittelwerte der
pro Well waschen. Wells durch Ausschlagen auf Doppelbestimmung der gemessenen Kalibrator-
saugfähigem Papier sorgfältig trocknen, um den Absorption berechnen. Die Absorption (dividiert durch sich
Waschpuffer vollständig zu entfernen. selbst) wird auf 1 gesetzt (Normalisierung).
7. 100 µL Enzymmarker IgM zu jedem Well hinzugeben. Proben und Kontrollen: Absorption bei 450 nm messen.
8. Mikrotiter-Platte mit einer Abdeckfolie abdecken und Der mittlere Blank-OD wird vom OD-Mittelwert jeder
2 Stunden (±5 Minuten) bei 2-8 °C inkubieren. Probe und Kontrolle subtrahiert. Mittelwerte der Doppel-
9. Abdeckfolie entfernen. Die Wells entleeren und vier bestimmungen der gemessenen Absorptionen berechnen.
Mal mit jeweils mindestens 300 µL kaltem Waschpuffer Berechnung des Verhältnisses (Ratio) zwischen den
pro Well waschen. Wells durch Ausschlagen auf Absorptionsmittelwerten der Kontrollen/ Proben und des
saugfähigem Papier sorgfältig trocknen, um den Absorptionsmittelwerts des Kalibrators.
Waschpuffer vollständig zu entfernen. Absorptionsmittelwer t der Proben
Hinweis: TMB-Substratlösung auf Raumtemperatur Ratio (Verhältnis) =
Absorptionsmittelwer t des Kalibrators
äquilibrieren (18-28 °C).
10. 100 µL TMB-Substrat zu jedem Well hinzugeben. Hinweis: Die Ergebnisse in Tabelle 3 sind Beispiele.
11. Mikrotiterplatte mit Abdeckfolie abdecken und 30 ± 2 Kalibrator und Kontrollen müssen in jedem individuellen
Minuten bei 18-28 °C auf einem Mikrotiter- Assay verwendet werden.
plattenschüttler bei 400-600 U/min inkubieren. Platte
vor direktem Licht schützen. EINSCHRÄNKUNGEN DER LEISTUNGSMERKMALE
12. 100 µL Stopplösung zu jedem Well hinzugeben. 1. Die Ergebnisse sollten in Verbindung mit der
Innerhalb von 30 Minuten mit Schritt 13 fortfahren Anamnese des Patienten und weiteren diagnostischen
13. Absorption bei 450 nm mit einem Mikrotiter-Platten- Tests verwendet werden.
Photometer messen. 2. Der anti-SGPG Autoantikörper ELISA wurde nicht für
Plasmaphereseproben getestet.
QUALITÄTSKONTROLLE
Für zuverlässige Ergebnisse ist ein gutes Verständnis REFENZINTERVALLE UND CUT-OFF RATIO
dieser Gebrauchsanweisung notwendig. Zuverlässige Vorgeschlagenes Cut-off Verhältnis (Ratio)
Resultate werden nur durch die Anwendung „Guter Das Normalwertverhältnis von anti-SGPG wurde anhand
Laborpraxis“ (aktuelle GLP Richtlinien) und die genaue von 200 Blutproben von asymptomatischen freiwilligen
Einhaltung der Arbeitsanleitung erreicht. Blutspendern, (49 weiblich, 151 männlich im Alter
BÜHLMANN empfiehlt die Erhebung von Doppelwerten zwischen 18-70 Jahren) welche entsprechend der
und die Verwendung des daraus berechneten Mittelwerts. Arbeitsanleitung getestet wurden, ermittelt. Nur 1/200
Da es keine kommerziell erhältliche anti-SGPG (0,5 %) Proben zeigte ein Verhältnis (Ratio) >1. Sechs
Autoantikörper Kontrolle gibt, wird empfohlen, positive Seren zeigten ein Verhältnis zwischen 0,5 und 0,6,
und negative Serumproben als interne Qualitätskontrolle während 193/200 (96,5 %) Seren ein Verhältnis unter 0,5
anzuwenden. zeigten.
Alle Kontrollen müssen im etablierten Vertrauensbereich 14 anti-MAG positive Seren wurden getestet. Jedes
liegen. Die Vertrauensbereiche der Kontrollen sind lot- dieser Seren wies ein Verhältnis 2,4 oder höher auf. Die
spezifisch und auf dem zusätzlichen Kontrollblatt Resultate sind in Tabelle 4 dargestellt. BÜHLMANN
angegeben.Die Leistungsmerkmale müssen innerhalb der schlägt die Verwendung eines Cut-off von 1 vor.
etablierten Grenzwerte liegen. Falls die
Zusätzlich wurde in einer externen Studie bei 223 Seren
Leistungsmerkmale des Tests nicht in den angegebenen
von vermuteten Neuropathie Patienten der oben
Bereichen liegen und Wiederholungsmessungen ein
genannte Cut-off verifiziert. 178 Seren wurden mit der
technisches Problem ausschließen, sind folgende
Referenzmethode, Dünnschichtchromatographie (TLC)
Bedingungen zu überprüfen: i) Wurden alle Reagenzien in
wie in der Literatur beschrieben (4), getestet. 99/110
Schritt 3-10 bei 2-8 °C verarbeitet? ii) Pipetten,
positiven TLC Seren konnten im anti-SGPG
Temperatur- und Zeitmessende Geräte, iii) Photometer
Release date: 2020-07-16 9/32 anti-SGPG Autoantibodies ELISAAutoantikörper ELISA auch als positiv gemessen werden. 2. Spezifität der anti-SGPG Autoantikörper Bindung: Zehn 66/68 TLC negative Seren wurden im ELISA ebenfalls als Seren mit mittel bis hohen anti-Gangliosid Autoantikörper negativ gemessen. Dies ergibt eine berechnete Titer (GA1, GM1, GM2, GD1a, GD1b und GQ1b) sowie Sensitivität und Spezifität des ELISA von 90,0 % und fünf negative Seren wurden im anti-SGPG Autoantikörper 97,1 %. (persönliche Kommunikation mit Dr. C. Caudie, ELISA getestet. 9/10 positiven, sowie alle negativen Lyon F.). Seren ergaben ein Ratio (Verhältnis) von
FRANCAIS
Réactifs Quantité Code Reconstitution
DOMAINE D’UTILISATION Contrôles bas, A reconstituer
medium et elevé 2 B-SGPG- avec 1 mL de
Le test ELISA Autoanticorps anti-SGPG de BÜHLMANN 3 flacons
Sérum humain avec CONSET tampon
est destiné à la détermination diagnostique semi- conservateurs d’incubation
quantitative in vitro des auto-anticorps à IgM humaine Marqueur
dirigés contre le sulfate-3-glucuronyl-paragloboside enzymatique IgM
[SGPG] et le sulfate-3-glucuronyl-lactosaminyl-para- Anticorps anti-IgM
1 flacon B-SGPG- Prêt à l’emploi
globoside [SGLPG]. Le test aide à diagnostiquer la humaine conjugué à
la HRP dans un 11 mL ELM Solution bleue
neuropathie démyélinisante paraprotéinémique (NDP) en
tampon à base de
conjonction avec d’autres résultats cliniques et protéines contenant
analytiques (1-6). des conservateurs
Substrat TMB
1 flacon
PRINCIPE DU DOSAGE TMB dans tampon B-TMB Prêt à l’emploi
11 mL
citrate
Le test ELISA Autoanticorps anti-SGPG repose sur la
technique de dosage immunologique de type sandwich à Solution stop 1 flacon Prêt à l’emploi
B- STS
amplification enzymatique. Les microplaques du test sont 0,25 M H2SO4 11 mL Corrosif
préalablement revêtues de SGPG et de SGLPG Tableau 1
hautement purifiés de queue de cheval bovine. Le 1) Le calibrateur est produit à partir d’un échantillon positif dilué et
calibrateur, les contrôles et le sérum du patient sont standardisé par rapport à une référence interne (cf. paragraphes
incubés dans les puits de la microplaque et les auto- Standardisation et Valeur Seuil).
2)
Les contrôles bas, medium et élevé contiennent des quantités
anticorps anti-SGPG présents dans les échantillons se d’anticorps anti-SGPG spécifiques à chaque lot. Il convient de se
lient au SGPG/ SGLPG immobilisé. Après le rinçage des référer aux limites de confiance communiquées avec chaque lot de
substances non liées, les auto-anticorps anti-SGPG sont production.
détectés avec des anticorps marqués à la peroxydase de
raifort (HRP) dirigés contre l’IgM humaine. Après une STOCKAGE ET PEREMPTION DES REACTIFS
deuxième étape de lavage, dans laquelle le marquage
Réactifs Fermés / Non entamés
enzymatique non lié est éliminé, une solution de substrat
contenant de la tétraméthyl-benzidine (TMB) est ajoutée. Tous les composants du kit scellés/fermés sont stables à 2-8 °C
jusqu’à la date de péremption imprimée sur les étiquettes.
Une coloration bleue apparaît proportionnellement à la
quantité d’auto-anticorps anti-SGPG liés au SGPG et au Réactifs Ouverts / Reconstitués
SGLPG immobilisés. Le développement de la coloration Replacer immédiatement les barrettes de 8 puits non
est arrêté en ajoutant une solution stop acide (acide Microplaque
utilisées dans la pochette d’aluminium contenant le
sulfurique dilué) qui change la solution bleue en une dessiccateur puis la refermer soigneusement. Se
conserve pendant 2 mois à 2-8 °C.
solution jaune. L’intensité de la couleur est mesurée à
450 nm. Tampon de
Se conserve pendant 2 mois à 2-8 °C.
lavage dilué
L’absorbance mesurée est proportionnelle au titre d’auto-
anticorps présents dans un échantillon donné. Les titres Calibrateur
Se conserve pendant 2 mois à –20 °C.
des auto-anticorps anti-SGPG humain sont exprimés sous Contrôles
forme de rapports du calibrateur et peuvent être assignés Tampon
à des catégories de titres. d’incubation
Marqueur Stable à 2-8 °C jusqu’à la date de péremption
REACTIFS FOURNIS ET PREPARATION enzymatique imprimée sur l’étiquette.
Substrat de
Réactifs Quantité Code Reconstitution TMB
Microplaque 12 barrettes Stable à 18-28 °C jusqu’à la date de péremption
Solution stop
96 puits, précoatée- de 8 puits imprimée sur l’étiquette.
B-SGPG-MP Prête à l’emploi
SGPG d’origine avec Tableau 2
bovine support
Film adhésif 3 MATERIEL REQUIS MAIS NON FOURNI
Tampon de lavage A reconstituer
concentré (10x)
1 flacon • Pipettes de précision capables de pipeter les volumes
B-MAG-WB avec 900 mL
Avec conservateurs
100 mL d’eau déionisée suivants 2 µL, 100 µL et 1000 µL avec pointes
jetables.
Tampon
1 flacon • Tubes en polystyrène ou polypropylène jetables, pour
d’incubation B-MAG-IB Prêt à l’emploi
100 mL la préparation des dilutions.
Avec conservateurs
Calibrateur 1 A reconstituer • Eprouvette graduée de 1000 mL pour la préparation
1 flacon B-SGPG-CA
avec 1 mL de du tampon de lavage à partir du concentré.
Sérum humain avec tampon
conservateurs d’incubation • Flacon souple pour tampon de lavage ou dispositif de
lavage automatique de microplaques.
• Papier absorbant.
• Agitateur orbital pour microplaques.
Release date: 2020-07-16 11/32 anti-SGPG Autoantibodies ELISA• Lecteur de microplaques pour la mesure de • Etape 10: S’assurer d’utiliser du substrat TMB
l’absorbance à 450 nm. préalablement porté à température ambiante
(18-28 °C).
PRECAUTIONS • Etape 11: Bien agiter les microplaques durant
l’incubation avec le substrat. Les rpms données
Précautions de sécurité
(400-600) ne s’appliquent pas à tous les agitateurs de
• Le calibrateur (B-SGPG-CA) et les contrôles de cette microplaques. La solution doit s’agiter dans les puits
trousse (B-SGPG-CONSET) contiennent des mais sans déborder.
composants d’origine humaine. Bien que les tests de
• Pour les laveurs automatiques, BÜHLMANN utilise le
détection de l’antigène de surface du VHB et des
mode “plate mode” i.e. chaque étape du processus
anticorps des virus VHC et VIH1/2 se soient révélés
(distribution ou “dispense“) est réalisée
négatifs, il convient de considérer les réactifs comme
séquentiellement pour toutes les barrettes, avant de
capables de transmettre des maladies infectieuses, et
procéder à l’étape suivante du processus (aspiration).
de les manipuler conformément aux bonnes pratiques
de laboratoire, en prenant les précautions appropriées. • Les composants ne doivent pas être utilisés au-delà
de la date d'expiration imprimée sur les étiquettes.
• Solution stop: La solution stop (B-STS) contient de
l’acide sulfurique (0,25 M). Le réactif est irritant pour • Ne pas mélanger des réactifs de lots différents.
les yeux, la peau ainsi que les muqueuses. Éviter tout • Il convient de prendre toutes les précautions requises
contact avec les yeux, la peau et les vêtements. En pour empêcher toute contamination croisée entre
cas de contact accidentel avec les yeux ou la peau, il réactifs, entre échantillons ou entre puits.
faut impérativement rincer à grande eau.
• Les micropuits sont à usage unique.
• Réactifs: Éviter tout contact des réactifs avec la peau,
les yeux ou les muqueuses. En cas de contact PRELEVEMENT ET CONSERVATION DES
accidentel, il faut impérativement rincer à grande eau ECHANTILLONS
pour éviter tout risque d’irritation ou de brûlures.
• Pour en savoir plus sur les précautions pour la • La procédure requiertfilm contenant le dessicateur. Conserver au Nous recommandons fortement de travailler en duplicat
réfrigérateur. (blanc, calibrateur, contrôles et échantillons).
Remarque: Utiliser des réactifs froids dans les étapes Comme il n’existe pas de sérum anti-SGPG de référence
3 à 9. commercialement disponible, nous recommandons
l’utilisation d’un pool de sérums positifs et de sérums
3. Laver les puits revêtus quatre fois avec au moins
négatif en tant que contrôle de qualité interne.
300 µL de tampon de lavage froid! par puits. Vider les
Tous les contrôles doivent être inclus dans les intervalles
puits et tapoter fermement la plaque sur le papier
de confiance établis. Les intervalles de confiance pour les
absorbant pour éliminer complètement le liquide
contrôles sont spécifiques au lot et inscrites sur la fiche de
restant.
données de QC fournie avec le kit.
4a. Distribuer 100 µL de tampon d’incubation (« blanc ») Les caractéristiques de performances doivent être
en double dans les puits A1 et A2. incluses dans les limites établies. Si ces caractéristiques
4b. Distribuer 100 µL de calibrateur en double dans ne sont pas conformes aux limites établies et que la
B1+B2. répétition permet d’exclure les erreurs de manipulation,
4c. Distribuer 100 µL de contrôle bas en double dans vérifier les conditions suivantes : i) Tous les réactifs
C1+C2. utilisés dans les étapes 3 à 10 ont-ils été conservés à 2-
8 °C ? ii) Précision des pipettes, des thermomètres et des
4d. Distribuer 100 µL de contrôle medium en double dans
chronomètres iii) Paramètres du dispositif de lecture et de
D1+D2.
lavage ELISA, iv) Date de péremption des réactifs v)
4e. Distribuer 100 µL de contrôle élevé en double dans Conditions de stockage et d’incubation vi) Couleur de la
E1+E2. solution de substrat TMB (elle doit être incolore) vii)
4f. Distribuer 100 µL d’échantillons dilués en double dans Pureté de l’eau.
les puits suivants
5. Couvrir la microplaque à l’aide du film adhésif fourni et STANDARDISATION
incuber à 2-8 °C pendant 2 heures (±5 minutes).
Le calibrateur de cette trousse a été standardisé à l’aide
6. Retirer le film adhésif de la plaque. Vider puis laver les d’une référence interne produite par dilution d’un
puits quatre fois avec au moins 300 µL de tampon de échantillon sérique positif. Cette dilution se situe dans
lavage froid (2-8 °C) par puits. Vider les puits et l’intervalle des DO des échantillons sériques de donneurs
frapper fermement la plaque contre le papier normaux et celles des échantillons positifs.
absorbant pour éliminer complètement le tampon de
lavage. RESULTATS
7. Ajouter 100 µL de marqueur enzymatique dans
Calibrateur: Mesurer l’absorbance à 450 nm (DO450) et
chaque puits.
soustraire la moyenne des « blancs ». Calculer la
8. Recouvrir la microplaque d’un nouveau film adhésif et moyenne des deux valeurs obtenues. Le ratio du
incuber à 2-8 °C pendant 2 heures (±5 minutes). calibrateur est fixé à 1 (divisé par lui-même).
9. Retirer le film adhésif de la plaque. Vider puis laver les Echantillons et contrôles: Mesurer l’absorbance à 450 nm
puits quatre fois avec au moins 300 µL de tampon de (DO450) de chaque puits contenant un contrôle ou un
lavage froid (2-8 °C) par puits. Vider les puits et échantillon et soustraire la moyenne des « blancs ».
frapper fermement la plaque contre le papier Calculer la moyenne des deux valeurs obtenues. Calculer
absorbant pour éliminer complètement le tampon de le ratio de la moyenne d’absorbance obtenue / moyenne
lavage. d’absorbance du calibrateur.
Remarque: Ajuster la solution de substrat TMB à
température ambiante (18-28 °C). moyenne nette DO450 échantillon
Ratio =
moyenne nette DO450 calibrateur
10. Ajouter 100 µL de solution de substrat dans chaque
puit. Remarque: Les résultats présentés dans le tableau 3
11. Recouvrir la plaque d’un film adhésif, incuber la plaque sont des exemples. Le calibrateur et les contrôles doivent
sur un agitateur de plaques orbital à 400-600 rpm être utilisés dans chaque série de dosage.
pendant 30 ± 2 minutes à 18-28 °C. Protéger la plaque
de la lumière directe. LIMITES
12. Ajouter 100 µL de solution stop dans chaque puits.
1. Les résultats du test doivent être interprétés en tenant
Passer à l’étape 13 dans les 30 minutes qui suivent.
compte des informations résultant de l’examen clinique
13. Lire l’absorbance à 450 nm à l’aide d’un lecteur de du patient et d’autres procédures diagnostiques.
microplaques.
2. Le test ELISA Autoanticorps anti-SGPG n’a pas été
validé pour les échantillons de plasmaphérèse.
CONTROLE QUALITE
Il est nécessaire de bien comprendre ces instructions INTERVALLES DES REFERENCES ET VALEURS
d’utilisation pour obtenir des résultats fiables. Ce but ne SEUIL (CUT-OFF)
sera atteint que par un travail en laboratoire précis
Cut-off/ Valeur seuil proposé(e)
(bonnes pratiques de laboratoire usuelles) et en suivant
fidèlement les recommandations de cette brochure. Le « background ratio » d’anti–SGPG a été défini à partir
du dosage, selon la procédure standard, des échantillons
Release date: 2020-07-16 13/32 anti-SGPG Autoantibodies ELISAde 200 donneurs de sang asymptomatiques (49 femmes 1. Neutralisation des auto-anticorps anti-SGPG: La et 151 hommes âgés de 18 à 70 ans). Seul 1 échantillon fixation de deux échantillons sériques présentant des taux sur les 200 testés (0,5 %) a présenté un ratio >1. Six élevés d’auto-anticorps anti-SGPG à la microplaque échantillons ont présenté un ratio compris entre 0,5 et 0,6, coatée de SGPG a pu être inhibée de manière alors que 193 échantillons sur 200 (96,5 %) ont présenté concentration-dépendante après pré-incubation durant 16 des valeurs inférieures à 0,5. heures à 4 °C dans du tampon d’incubation additionné 14 échantillons sériques anti-MAG positifs ont également concentrations croissantes de SGPG (32 ng à 1.6 µg été analysés. Leurs ratios étaient tous ≥2,4. Les résultats SGPG) avant de procéder au dosage. se trouvent en tableau 4. En conséquence, nous 2. Spécificité de liaison des auto-anticorps anti-SGPG: proposons une valeur seuil (cut-off) de 1. Dix échantillons sériques présentant des taux moyens à De plus, au cours d’une étude externe, cette valeur seuil a élevés d’auto-anticorps anti-Ganglioside (GA1, GM1, été vérifiée sur 223 échantillons sériques de patients chez GM2, GD1a, GD1b et GQ1b) ainsi que cinq échantillons lesquels une neuropathie était suspectée. 178 sériques négatifs furent analysés à l’aide du test échantillons furent testés au moyen de la technique de autoanticorps anti-SGPG ELISA. Neuf échantillons sur les détection (TLC), chromatographie sur couche mince, dix pathologiques ainsi que les cinq échantillons négatifs méthode de référence, décrite dans la littérature (4). ont présenté des ratios inférieurs à 0,6. Sur le seul 99/110 échantillons TLC positifs le furent également avec échantillon positif, une recherche d’auto-anticorps anti- du test ELISA Autoanticorps anti-SGPG. 66/68 SGPG et anti-GD1a a été effectuée par TLC échantillons TLC négatifs le furent également avec (chromatographie sur couche mince). La présence des l’ELISA. Ces données deux types d’auto-anticorps a été confirmée par cette permettent de définir une sensibilité de 90,0 % et une méthode. spécificité de 97,1 % pour l’ELISA (communication personnelle Dr C. Caudie, Lyon, F.). CARACTERISTIQUES DE PERFORMANCE Précision intra-essai: 4,9 %. La précision intra-essai a été calculée à partir des mesures de 20 duplicats de chaque échantillon lors d’un seul et même essai (tableau 5). Précision inter-essai: 10,0 %. La précision inter-essai a été calculée à partir des résultats de 20 duplicats de 6 échantillons sériques humains lors de 20 essais différents (tableau 6). Linéarité de dilution/ parallélisme: 154 %. 13 échantillons sériques humains présentant des taux élevés d’auto-anticorps anti-SGPG élevés furent dilués du 1000ème au 128’000ème (de 1:1000 à 1:128’000), incubés durant une heure à 18-28 °C puis dosés selon le protocole standard. Le ratio VO/VA (valeur observée/valeur attendue) a été calculé étape par étape (tableau 7). Il est probable que la déviation importante observée pour environ 50 % des échantillons soit due à l’agrégation d’anticorps. En général, les échantillons pathologiques présentent des taux d’auto-anticorps très élevés. Cette déviation n’a donc pas d’influence sur l’interprétation des résultats. Limite de blanc (LoB) :
ITALIANO
Reagenti Quantità Codice Ricostituzione
USO Marcato enzimatico
IgM
Il dosaggio Autoanticorpi anti-SGPG ELISA BÜHLMANN Anticorpo anti-IgM 1 flacone B-SGPG- Pronto all’uso
è destinato alla determinazione diagnostica umane coniugato a ELM
11 mL Soluzione Blu
semiquantitativa in vitro di autoanticorpi IgM umani diretti HRP in un tampone a
contro la solfato-3-glucuronil paragloboside [SGPG] e la base proteica con
conservanti.
solfato-3-glucuronil-lactosaminil-paragloboside [SGLPG].
Il test serve come ausilio nella diagnosi della neuropatia Substrato TMB
1 flacone
demielinizzante paraproteinemica (PDN) in aggiunta ad TMB in un tampone B-TMB Pronto all’uso
11 mL
altri risultati clinici e di laboratorio (1-6). citrato
Soluzione stoppante Pronto all’uso
1 flacone
B- STS
PRINCIPIO DEL DOSAGGIO 0,25 M di acido solforico 11 mL Agente
corrosivo
Il dosaggio Autoanticorpi anti-SGPG ELISA utilizza una Tabella 1
tecnica di immunodosaggio tipo sandwich amplificato 1) Il calibratore è composto da un siero positivo diluito standardizzato
enzimaticamente. Le micropiastre del test sono coattate secondo un riferimento interno stabilito (vedi capitolo
con SGPG e SGLPG di cauda equina bovina altamente standardizzazione e cut-off).
purificate. Calibratore, controlli e sieri dei pazienti sono
2)
Il controllo basso, medio ed alto contengono quantitativi lotto-specifici
di anticorpi anti-SGPG. Fare riferimento ai dati di QC forniti con il kit
incubati nei pozzetti di microtitolazione e gli autoanticorpi per i valori corrispondenti.
anti-SGPG presenti nei campioni si legano alla SGPG/
SGLPG immobilizzata. Dopo l’eliminazione mediante
CONSERVAZIONE ED EMI-VITA DEI REAGENTI
lavaggio delle sostanze libere, gli autoanticorpi anti-SGPG
vengono rilevati con anticorpi contro le IgM umane Reagenti Sigillati / (Non aperti)
marcati con perossidasi di rafano (HRP). Dopo un Tutti i component del kit sigillati/ non aperti sono stabili a 2-8 °C fino
secondo lavaggio, nel quale viene rimosso il marcatore alla data di scadenza indicata sulle etichette.
enzimatico libero, viene aggiunta una soluzione di Reagenti Aperti / Ricostituiti
substrato contenente tetrametilbenzidina (TMB). Si
sviluppa un colore blu proporzionale alla quantità di Riporre le strip non utilizzate
immediatamente nella busta di alluminio che
autoanticorpi anti-SGPG legati alle SGPG e SGLPG Micropiastra contiene il dessiccante e risigillarle
immobilizzate. Lo sviluppo di colore viene interrotto completamente chiudendo la zip. Conservare
mediante l’aggiunta di una soluzione bloccante acida fino a 2 mesi a 2-8 °C.
(acido solforico diluito) che vira la soluzione da blu a giallo Tampone di lavaggio
Conservare fino a 2 mesi a 2-8 °C.
L’intensità del colore viene misurata a 450 nm. diluito
L’assorbanza misurata è proporzionale al titolo di Calibratore
autoanticorpi presenti in un dato campione. I titoli di Conservare fino a 2 mesi a –20 °C
Controlli
autoanticorpi anti-SGPG umana sono espressi come
Tampone di
rapporti del calibratore e possono essere assegnati a incubazione
categorie di titolo. Conservare a 2-8 °C fino alla data di
Marcato enzimatico scadenza indicata sulle etichette.
Substrato TMB
REAGENTI FORNITI E PREPARAZIONE EAGENTS
Conservare a 18-28 °C fino alla data di
Soluzione bloccante
scadenza indicata sulle etichette.
Reagenti Quantità Codice Ricostituzione
Tabella 2
Micropiastra Strip da 12 x
B-SGPG-
96 pozzetti precoattati 8-pozzetti con Pronto all’uso MATERIALI RICHIESTI MA NON FORNITI
MP
con SGPG bovina supporto
Foglio sigillante per la • Pipette di precisione con puntali monouso in grado di
3 fogli
piastra pipettare i seguenti volumi; 2 µL, 100 µL e 1000 µL.
Tampone di lavaggio Diluire con • Provette monouso di polistirene o polipropilene per la
1 flacone B-MAG- 900 mL di
concentrato (10x) preparazione delle diluizioni del campione.
100 mL WB acqua
Con conservanti deionizzata • Beuta a cilindro da 1000 mL per la diluizione del
Tampone di tampone di lavaggio concentrato
1 flacone
incubazione B-MAG-IB Pronto all’uso • Flacone dosatore per il tampone di lavaggio o lavatore
100 mL
Con conservanti automatico per micropiastre.
Calibratore1 Aggiungere • Carta assorbente.
B-SGPG- 1 mL di
Siero umano con 1 flacone
CA tampone di • Agitatore orbitale per micropiastre.
conservanti incubazione
• Lettore di micropiastra per la misurazione
Controllo basso, Aggiungere dell’assorbanza a 450 nm.
medio e alto2 B-SGPG- 1 mL di
3 flaconi
Siero umano con CONSET tampone di
conservanti incubazione
Release date: 2020-07-16 15/32 anti-SGPG Autoantibodies ELISAPRECAUZIONI micropiastra deve essere agitata efficacemente, ma
facendo in modo di evitare la fuoriuscita di liquido.
Precauzioni di sicurezza
• Usando dispositivi automatici per lavaggio/ aspirazione
• Il calibratore (B-SGPG-CA) ed i controlli di questo kit
della micropiastra, BÜHLMANN consiglia l’utilizzo della
(B-SGPG-CONSET) contengono componenti di origine
modalità: “plate mode”; dispensazione sequenziale in
umana. Benché testati e risultati negativi all’antigene di
tutte le strip e successiva aspirazione.
superficie HBV e agli anticorpi HCV e HIV1/2, i
reagenti devono essere maneggiati come • I componenti non devono essere utilizzati dopo la data
potenzialmente infettivi e secondo le buone pratiche di di scadenza riportata sulle etichette.
laboratorio utilizzando le dovute precauzioni. • Non miscelare reagenti appartenenti a lotti diversi.
• Soluzione stoppante: La soluzione stoppante (B-STS) • Fare ogni tentativo per assicurarsi che tra i reagenti, i
contiene acido solforico (0,25 M). Il reagente è irritante campioni o tra i pozzetti non vi siano contaminazioni
per gli occhi, per la pelle e per le membrane mucose. incrociate.
Evitare il contatto con gli occhi, la pelle e gli indumenti.
• I micropozzetti non possono essere riutilizzati.
In caso di contatto con gli occhi o con la pelle, lavare
immediatamente con abbondante acqua.
PRELIEVO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI
• Reagenti: Evitare il contatto dei reagenti con la pelle,
gli occhi o le membrane mucose. In caso di contatto, • La procedura richiede4b.Dispensare 100 µL del calibratore in duplicato nei manipolazione, controllare i seguenti aspetti: i) tutti i
pozzetti B1+B2. reagenti utilizzati nei punti 3-10, sono stati tenuti a 2-
4c.Dispensare 100 µL del controllo basso in duplicato nei 8 °C? ii) accuratezza delle pipette, dei termometri e dei
C1+C2. cronometri, iii) impostazioni del lavatore e del lettore
ELISA, iv) data di scadenza dei reagenti v) condizioni di
4d. Dispensare 100 µL del controllo medio in duplicato nei
conservazione e di incubazione vi) colore della soluzione
D1+D2.
di substrato TMB (deve essere incolore) vii) purezza
4e. Dispensare 100 µL del controllo alto in duplicato nei dell’acqua.
E1+E2.
4f. Dispensare 100 µL di ciascun campione diluito in STANDARDIZZAZIONE
duplicato nei pozzetti successivi.
Il calibratore del kit è sono standardizzati verso un pool di
5. Coprire la piastra con un foglio sigillante ed incubare
riferimento interno (siero positivo diluito). La diluizione è
per 2 ore (±5 min) a 2-8 °C.
stata scelta nel range tra la OD di donatori normali e sieri
6. Rimuovere il foglio sigillante dalla piastra. Svuotare i positivi.
pozzetti e lavare quattro volte usando almeno 300 µL
di tampone di lavaggio freddo (2-8 °C) per pozzetto. RESULTATI E CALCOLO
Svuotare i pozzetti e picchiettare fermamente la
piastra su carta assorbente per rimuovere Calibratore: Memorizzare l’assorbanza a 450 nm (OD450)
completamente il tampone di lavaggio. e sottrarre il valore medio del bianco campione. Fare la
media dei valori duplicati. Il Rapporto del calibratore è
7. Aggiungere 100 µL di marcato enzimatico (soluzione
settato ad un valore 1 (diviso per se stesso).
blu) a tutti i pozzetti.
Campioni e controlli: Memorizzare l’assorbanza a 450 nm
8. Coprire la piastra con un nuovo foglio sigillante, ed
(OD450) per ciascun campione e pozzetto del controllo e
incubare per 2 ore (±5 min) a 2-8 °C.
sottrarre il valore medio del bianco campione. Fare la
9. Rimuovere il foglio sigillante dalla piastra. Svuotare i media dei valori duplicati. Calcolare il rapporto tra
pozzetti e lavare quattro volte usando almeno 300 µL l’assorbanza media del campione e l’assorbanza media
di tampone di lavaggio freddo (2-8 °C) per pozzetto. del calibratore.
Svuotare i pozzetti e picchiettare fermamente la
piastra su carta assorbente per rimuovere media netta OD450 del campione
Rapporto =
completamente il tampone di lavaggio. media netta OD450 del calibratore
Nota: equilibrare la soluzione di substrato TMB a Nota: I risultati presentati in tabella 3 sono esempi. Si
temperatura ambiente (18-28 °C). devono usare calibratore e controlli per ogni singolo
10. Aggiungere 100 µL di soluzione di substrato TMB a dosaggio.
tutti i pozzetti.
11. Coprire la piastra con un foglio sigillante per piastra, LIMITI DELLE PRESTAZIONI
incubare la piastra in un agitatore orbitale per piastre a
1. I risultati del test vanno interpretati insieme alle
400-600 rpm per 30 ± 2 minuti a 18-28 °C. Proteggere
informazioni derivanti dagli studi epidemiologici, dalla
la piastra dalla luce solare diretta.
valutazione clinica del paziente e da altre procedure
12. Aggiungere a tutti i pozzetti 100 µL di soluzione diagnostiche.
stoppante. Passare al punto 13 entro 30 minuti.
2. Il dosaggio Autoanticorpi anti-SGPG ELISA non è
13. Leggere l’assorbanza a 450 nm in un lettore per stato validato per campioni di plasmaferesi.
micropiastre.
INTERVALLOS DE REFERENZIA E CUT-OFF
CONTROLLO DI QUALITA
Rapporto di cut-off suggerito
È necessario comprendere bene le presenti istruzioni per Il rapporto di background del kit anti-SGPG è stato
l’uso per arrivare a risultati affidabili, che si otterranno solo determinato utilizzando 200 campioni di sangue da
adottando tecniche di laboratorio precise (le attuali linee donatori volontari asintomatici (49 femmine, 151 maschi di
guida di buona pratica di laboratorio) e seguendo con età compresa tra 18 e 70 anni) che sono stati testati
attenzione le istruzioni per l’uso. secondo la procedura del dosaggio. Soltanto 1/200
BÜHLMANN consiglia caldamente di testare il bianco, il (0,5 %) dei campioni hanno presentato un rapporto di >1.
calibratore, i controlli ed i campioni in duplicato. Sei sieri hanno presentato un rapporto tra 0,5 e 0,6,
Poiché non vi è nessun siero di controllo disponibile in mentre 193/200 (96,5 %) sieri hanno presentato un
commercio per gli anticorpi anti-SGPG, consigliamo rapporto al di sotto di 0,5.
l’utilizzo di un pool di sieri positivi e negativi per i controlli Sono stati testati 14 sieri positivi anti-MAG. Ciascun siero
di qualità interni. ha presentato un rapporto di 2,4 o superiore. I risultati
Tutti i controlli devono rientrare negli intervalli di sono elencati in tabella 4. Quindi proponiamo un rapporto
confidenza stabiliti. Gli intervalli di confidenza dei controlli di cut-off di 1.
sono specifici per lotto e sono indicati nella scheda
Inoltre, in uno studio esterno comprendente 223 sieri di
informativa di controllo qualità inclusa nel kit.
pazienti affetti da una sospetta neuropatia, è stato
Le caratteristiche di prestazione devono rientrare nei limiti
verificato il cut-off più sopra proposto. Sono stati testati
stabiliti. Se tali caratteristiche non sono conformi ai limiti
178 sieri con il metodo di riferimento (TLC) cromatografia
stabiliti e la ripetizione del test esclude problemi di
Release date: 2020-07-16 17/32 anti-SGPG Autoantibodies ELISAYou can also read
