ANTI-GM1 AUTOANTIBODIES - ELISA WITH ENZYME LABELS IGG AND IGM - BÜHLMANN LABORATORIES AG
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anti-GM1 Autoantibodies
ELISA
with enzyme labels IgG and IgM
EK-GM1-GM 96 wells
Release date: 2018-11-05
Version A1
English page 3
BÜHLMANN Laboratories AG Deutsch Seite 7
Baselstrasse 55 Français page 11
4124 Schönenbuch, Switzerland
Italiano pagina 15
Tel.: +41 61 487 1212
Español página 19
Fax: +41 61 487 1234
info@buhlmannlabs.ch Português página 23Release date: 2018-11-05 2/32 EK-GM1-GM
ENGLISH Reagents Quantity Code Reconstitution
TMB Substrate 1 vial
B-TMB Ready to use
INTENDED USE TMB in citrate buffer 11 mL
Stop Solution 1 vial Ready to use
The assay anti-GM1 Autoantibodies ELISA is designed for B-STS
0.25 M sulfuric acid 11 mL Corrosive agent
the quantitative determination of IgG and/or IgM of auto-
Table 1
antibody isotype directed against GM1 in human serum
(ref. 1-7) using individual IgG- and IgM-conjugates.
STORAGE AND SHELF LIFE OF REAGENTS
PRINCIPLE OF THE ASSAY Sealed / Unopened Reagents
The anti-GM1 Autoantibodies ELISA is based on the All sealed/unopened kit components are stable at 2-8 °C until the
expiration date printed on the labels.
enzyme-immunometric assay technique. The wells of the
provided microtiter plate are coated with gangliosides: Opened / Reconstituted Reagents
GM1. Return unused strips immediately to the aluminum
Calibrator, controls, and patient sera are incubated in the pouch containing the desiccant packs and reseal
Microtiter Plate
along the entire edge of zip-seal. Store for up to 4
microtiter wells and anti-GM1 auto-antibodies present in months at 2-8 °C.
the samples bind to the immobilized GM1. After washing off Diluted Wash
unbound substances, the antibodies are detected with Store for up to 4 months at 2-8 °C.
Buffer
horseradish-peroxidase (HRP) labelled antibodies against Calibrator Store for up to 4 months at
human IgG and/or IgM. Following a second washing step in Controls 2-8 °C. Do not freeze!
which unbound enzyme label is removed, a substrate Incubation Buffer
solution containing tetramethyl-benzidine (TMB) is added. Store at 2-8° C until expiration date printed on the
Enzyme Label
labels.
A blue colour develops in proportion to the amount of anti- TMB Substrate
GM1 auto-antibodies bound to the gangliosides, GM1. Store at 18-28 °C until expiration date printed on the
Stop Solution
Colour development is stopped by adding an acidic stop labels.
solution (diluted sulphuric acid) which turns the blue Table 2
solution into yellow. The intensity of the colour is measured
at 450 nm. MATERIALS REQUIRED BUT NOT PROVIDED
The measured absorbance is proportional to the titre of
anti-GM1 auto-antibodies present in a given sample. The • Precision pipettes with disposable tips: 10 µL, 20 µL,
titres of anti-GM1 auto-antibodies are expressed as % 100 µL and 1000 µL pipettes
Ratios of the calibrator and can be assigned to titre • Disposable polystyrene or polypropylene tubes for the
categories (negative, grey zone, positive, strongly positive). preparation of sample dilutions
• 1000 mL cylinder for the reconstitution of the wash buffer
REAGENTS SUPPLIED AND PREPARATION
• Squeeze bottle for Wash Buffer or automatic microtiter
Reagents Quantity Code Reconstitution plate washer
Microtiter Plate • Blotting paper
12 x 8 wells B-GM1-MP Ready to use
precoated with GM1 • Orbital shaker for microtiter plates
Plate Sealer 3 pieces • Microtiter plate reader for measurement of absorbance at
Wash Buffer Concentrate
1 bottle Dilute with 450 nm
(10X) B-GCO-
900 mL of
100 mL WB
with preservatives deionized water
PRECAUTIONS
Incubation Buffer 1 bottle
B-GCO-IB Ready to use Safety Precautions
with preservatives 100 mL
Calibrator Add 1.5 mL of • Both, calibrator (B-GCO-CA) and controls (B-GCO-
Lyophilized with 1 vial B-GCO-CA Incubation CONSET) of this kit contain components of human
preservatives Buffer origin. Although tested and found negative for HBV
Negative, Low and surface antigen, HCV and HIV1/2 antibodies, the
Add 1.5 mL of
Medium Control
3 vials
B-GCO-
Incubation
reagents should be handled as if capable of transmitting
Lyophilized with CONSET infections and should be handled in accordance with
Buffer
preservatives
good laboratory practices using appropriate precautions.
Enzyme Label IgG
• Stop solution: The stop solution (B-STS) contains sulfuric
Anti-human IgG Ab 1 vial B-GCO-
conjugated to HRP in a Ready to use acid (0.25 M). The reagent is an irritant to eyes, skin and
11 mL ELG
protein-base buffer with mucous membranes. Avoid contact with eyes, skin and
preservatives clothes. After contact with eyes or skin, wash
Enzyme Label IgM immediately with plenty of water.
Anti-human IgM Ab 1 vial B-GCO- • Reagents: Avoid contact of reagents with the skin, eyes,
conjugated to HRP in a Ready to use
protein-base buffer with
11 mL ELM or mucous membranes. If contact does occur,
preservatives immediately wash with generous amounts of water;
otherwise, irritation/ burns can occur.
• Unused solution should be disposed of according to local
state and federal regulations.
Release date: 2018-11-05 3/32 EK-GM1-GMTechnical Precautions • Store serum samples at ≤ -20 °C up to 4 months. For
• Read carefully the instructions prior to carrying out the long-term storage we recommend -70 °C (samples are
test. Test performance will be adversely affected, if stable for >1 year). Frozen samples should be thawed
reagents are incorrectly diluted, modified or stored and vortexed thoroughly prior to use.
under conditions other than those as detailed in this
instruction for use. ASSAY PROCEDURE
• Residues in the microtiter plate wells result from the 1. Dilute all samples to be investigated 1:50 with cold
production process. They are removed in the washing incubation buffer. Use e.g. 10 μL of serum + 490 μL of
step (assay procedure step 3) and do not affect the incubation buffer. Mix by vortexing and leave diluted
results. samples and reconstituted calibrator and controls for 30
• Prepare reagents before starting the assay procedure. minutes at 2-8 °C prior to pipetting.
Reagents used in steps 3-9 must be cold 2. Prepare a plate-frame with the required number of strips
(2-8 ˚C) and kept cold while pipetting and washing. Put to test the patient samples. Reseal the remaining strips
the TMB Substrate at room temperature (18-28 ˚C). in the foil pouch together with the desiccant packs
• Steps 3-9: Use cold (2-8 °C) reagents for all these steps immediately. Store refrigerated.
and keep them cold while pipetting. Recommendation: Note: Use cold reagents in steps 3 to 9.
Prepare the Wash Buffer the evening before performing 3. Wash coated wells twice using at least 300 µL of cold!
the assay and place it into the fridge overnight. Wash Buffer per well. Empty wells and tap plate firmly
• Wash steps 3, 6 and 9: The wash steps are crucial for onto blotting paper to remove remaining liquid
removing residues in the microtiter plate wells resulting completely.
from the production process (step 3) as well as any Note: Immediately proceed to the next steps.
unbound auto-antibodies (steps 6 and 9).
Detection of IgG-Isotype:
→ Always perform the wash steps with cold (2-8 ˚C)
Wash Buffer. Note: We recommend testing Calibrator, Controls and
→ Make sure that all wells are completely empty after samples in duplicates
the last washing cycle. 4a. Calibrator: Pipet 100 µL of the Calibrator into the well A1
• Step 9: Adjust TMB Substrate to room temperature and A2 (refer to figure 1).
(18-28 °C) before using it. 4b. Controls: Pipet 100 µL of the Control Medium into well
• Step 11: Shake the microtiter plates during the B1, and B2, Control Low into well C1 and C2 and Control
incubation with substrate. Depending on the orbital plate Negative into the well D1 and D2 (refer to figure 1).
shaker, we recommend 400-600 rpm. The solution 4c. Patient serum: Pipet 100 µL of diluted patient serum 1
should move in the wells but must not spill over. into the wells E1-E2 (refer to figure 1).
• If an automated washer is used, “plate mode” should be 4d.Patient serum: Pipet 100 µL of diluted patient serum 2
chosen so that dispensing is performed sequentially on into the wells F1-F2 (refer to figure 1).
all strips before aspirating. 4e. Pipet 100 µL of diluted patient sera x-y into the
• Components must not be used after the expiry date subsequent wells (refer to figure 1).
printed on the labels. Detection of IgM-Isotype
• Do not mix different lots of reagents. 4f. Repeat step 4a-4e using the subsequent wells.
• Every effort should be made to ensure that no cross
Sample incubation and washes
contamination occurs between reagents, samples or
between wells. 5. Cover the plate with a Plate Sealer and incubate for 2
hours ±5 minutes at 2-8 °C (do not shake the plate).
• Microwells cannot be re-used.
6. Remove Plate Sealer. Empty the wells and wash three
SPECIMEN COLLECTION AND STORAGE times using at least 300 µL of cold Wash Buffer (2-8 °C)
per well. Empty the wells and strike the plate firmly onto
• The procedure requires10. Add 100 µL of TMB Substrate Solution to each well. REFERENCE INTERVALS AND CUT-OFF RATIOS
11. Cover plate with a Plate Sealer, incubate plate on an
In co-operation with the institutions mentioned below, a cut-
orbital plate shaker at 400-600 rpm for 30 ± 2 minutes
off of 50 % has been established. Values 100
controls are lot-specific and indicated in the QC data sheet.
Performance characteristics should be within established Table 3
limits. If these characteristics are not in conformity with 1)
collected at the blood donation centre, University Hospital of Basel
established limits and repetition excludes handling failures, 2)
received from Friedrich-Baur-Institute, Ludwig-Maximilians-University of
check the following issues: i) Have all reagents, used in Munich; Department of Neurology, University of Basel; Department of
Neurology, University of Lyon.
step 3-10, been kept at 2-8 °C? ii) accuracy of pipets,
thermometers, and timers, iii) settings of ELISA washer and
reader, iv) expiration date of the reagents v) storage and PERFORMANCE CHARACTERISTICS
incubation conditions vi) colour of the TMB Substrate Intra-Assay Precision (Within-Run): 7.0 %
Solution (should be colourless) vii) purity of the water. The intra-assay precision was calculated from results of 12
values of three IgM and IgG samples in a single run. The
STANDARDIZATION values are listed in table 5 as % Ratio as described in
The Calibrator included in this kit has been calibrated “results and calculation”.
against internal reference material. It has been adjusted to Inter-Assay Precision (Run-to-Run): 11.1 %
100 % Ratio. The inter-assay precision has been determined by
measuring three serum samples with IgG and three with IgM
RESULTS AND CALCULATION antibodies to GM1 in 20 different runs. The values are listed
Calculation of Results: in table 6 as % Ratio as describe in “results and calculation”.
1. Record absorbance (OD) at 450 nm for each well Detection Limit (LOB)
(Calibrator, Controls and patient samples). 12 Incubation Buffer replicates were assayed in a single run.
2. Average the duplicate Calibrator and Control values (if The detection limit expressed as the % Ratio of the
available). calibrator was calculated to be ≤5 %.
3. Results are expressed as ratio of absorbance of Linearity
samples and the (averaged) absorbance of the
The linear range of the test system was assessed according
Calibrator.
to CLSI guideline EP06-A. The system is linear in the
diagnostic relevant range between 20 and 100 % Ratio.
absorbance of samples and Controls Results above 100 % Ratio are assessed clinically correct
x 100 and can be diluted into the linear range by an additional
% Ratio:
absorbance of Calibrator 1:5/1:10 dilution.
Specificity
Programs to calculate results as % Ratio are available on Different human serum samples containing specific anti-
most microplate readers. ganglioside IgM and/or IgG antibodies were incubated over
night with the corresponding soluble antigen in different
Note: Results presented in table 4 are examples. Calibrator concentrations and subsequently tested in the anti-GM1
and Controls must be used in each individual assay. Autoantibodies ELISA according to the assay procedure.
Specificity of the antibody binding was demonstrated by
LIMITATIONS inhibition with the corresponding antigen at concentrations
• The anti-GM1 Autoantibodies ELISA has not been between 1 and 100 µg/mL (data not shown).
validated for plasmapheresis samples.
Release date: 2018-11-05 5/32 EK-GM1-GMINTERFERING SUBSTANCES No interference is detected with the following substances up to the following concentrations: Triglycerides (Intralipid®): 3000 mg/dL; conjugated bilirubin: 60 mg/dL; unconjugated bilirubin: 40 mg/dL and hemoglobin: 400 mg/dL. Release date: 2018-11-05 6/32 EK-GM1-GM
DEUTSCH
Reagenz Inhalt Art.-Nr. Rekonstitution
ANWENDUNGSZWECK Enzymmarker-IgM
Anti-human-IgM, gekoppelt 1 Flasche
Der Test anti-GM1 Autoantibodies ELISA dient zur direkten mit HRP in einem Protein- B-GCO-ELM Gebrauchsfertig
11 mL
quantitativen, Bestimmung von IgG- und IgM-Antikörpern basierten Puffer mit
gegen das Gangliosid GM1 in humanem Serum (Ref. 1-7). Konservierungsmitteln
TMB-Substrat 1 Flasche
B-TMB Gebrauchsfertig
PRINZIP DER METHODE in Zitrat-gepufferter Lösung 11 mL
Stopp-Lösung 1 Flasche Gebrauchsfertig
Der vorliegende anti-GM1 Autoantibodies ELISA ist ein 0.25 M Schwefelsäure 11 mL
B-STS
Korrosiv
enzym-immunometrischer Festphasentest. Die
Tabelle 1
Mikrotiterplatte ist streifenweise mit GM1 beschichtet.
Kalibrator, Kontrollen und Serumproben werden in den
Wells der Mikrotiterplatte inkubiert und die potenziell LAGERUNG UND HALTBARKEIT DER REAGENZIEN
vorhandenen anti-GM1 Autoantikörper binden an das Ungeöffnete Reagenzien
immobilisierte GM1. Durch Waschschritte werden Zu verwenden bis zum Verfallsdatum angegeben auf der
ungebundene Substanzen entfernt. Die mit Meerrettich- Packungsetikette. Lagerung bei 2-8 °C.
peroxidase (HRP) markierten Antikörper werden gegen Geöffnete / Rekonstituierte Reagenzien
menschliches IgG und/oder IgM nachgewiesen. Nach Ungebrauchte Streifen sofort in die mit Trockenmittel
einem zweiten Waschschritt, bei dem der ungebundene Mikrotiterplatte versetzte Aluminiumpackung zurücklegen. Packung
Enzymmarker entfernt wird, wird eine Substratlösung, die völlig schliessen. Bis zu 4 Monate bei 2-8 °C haltbar.
Zu verwenden bis 4 Monate nach der Rekonstitution.
Tetramethylbenzidin (TMB) enthält, zugegeben. Durch die Waschpuffer
Bei 2-8 °C lagern.
Enzymreaktion entsteht eine Blaufärbung. Die Blaufärbung Kalibrator Zu verwenden bis 4 Monate nach der Rekonstitution.
verhält sich proportional zur Menge an Antikörpern, die an Kontrollen Bei 2-8 °C lagern. Nicht einfrieren!
die immobilisierten Ganglioside gebunden sind. Die Inkubations-
Zugabe einer sauren Stopp-Lösung (verdünnte puffer Zu verwenden bis zum Verfallsdatum.
Schwefelsäure) beendet die Reaktion und bewirkt einen Enzymmarker Bei 2-8 °C lagern.
TMB-Substrat
gelben Farbumschlag. Die bei einer Wellenlänge von
Zu verwenden bis zum Verfallsdatum.
450 nm gemessene optische Dichte der Lösung, ist Stopp-Lösung
Bei 18-28 °C lagern.
proportional zum Titer der anti-GM1 Autoantikörper in den
Tabelle 2
Proben. Die Titer der anti-GM1 Autoantikörper werden als
%-Verhältnis (% Ratio) zum Kalibrator angegeben und
kann zu den Titerkategorien zugeteilt werden (negativ, NICHT IM KIT ENTHALTENE ERFORDERLICHE
Grauzone, positiv, stark positiv). MATERIALIEN
• Präzisionspipetten mit Einwegspitzen für 10 µL, 20 µL,
GELIEFERTE REAGENZIEN UND VORBEREITUNG 100 µL und 1000 µL
Reagenz Inhalt Art.-Nr. Rekonstitution • Polystyren oder Polypropylen Einwegröhrchen zur
Mikrotiterplatte 8 x 12
Vorbereitung der Verdünnungsproben
B-GM1-MP Gebrauchsfertig
Beschichtet mit GM1 Wells • 1000 mL Zylinder zur Verdünnung des Waschpuffers
Abdeckfolien 3 Stück • Mikrotiterplatten-Waschautomat oder Spritzflasche für
Waschpufferkonzentrat Mit 900 mL Waschpuffer
1 Flasche
(10x) B-GCO-WB deionisiertem
100 mL Wasser verdünne
• Saugfähiges Papier
Mit Konservierungsmitteln
Inkubationspuffer 1 Flasche
• Orbitaler Mikrotiterplatten-Schüttler
B-GCO-IB Gebrauchsfertig
Mit Konservierungsmitteln 100 mL • Mikrotiterplatten-Photometer mit optischem Filter für
Kalibrator Mit 1.5 mL 450 nm
lyophilisiert mit 1 Flasche B-GCO-CA Inkubationspuffer
Konservierungsmitteln versetzen VORSICHTSMASSAHMEN
Kontrollen negativ, tief
und medium B-GCO-
Mit 1.5 mL Sicherheitsmassnahmen
3 Flaschen Inkubationspuffer
lyophilisiert mit CONSET
versetzen • Kalibrator (B-GCO-CA) und Kontrollen (B-GCO-
Konservierungsmitteln CONSET) enthalten Bestandteile humanen Ursprungs.
Enzymmarker-IgG Obwohl sie in Tests für HBV Oberflächenantigen-, HCV-
Anti-human-IgG, gekoppelt 1 Flasche und HIV1/2-Antikörper negativ waren, sollten sie gemäss
mit HRP in einem Protein- B-GCO-ELG Gebrauchsfertig
11 mL „Guter Laborpraxis“ als potentiell infektiös behandelt
basierten Puffer mit
Konservierungsmitteln
werden und die entsprechenden
Sicherheitsvorkehrungen getroffen werden.
• Stopp-Lösung: Die Stopp-Lösung (B-STS) enthält
Schwefelsäure (0,25 M). Das Reagenz reizt die Augen,
Haut und Schleimhäute. Kontakt mit Augen, Haut und
Kleidung vermeiden. Bei Berührung mit den Augen oder
der Haut sofort mit viel Wasser spülen.
Release date: 2018-11-05 7/32 EK-GM1-GM• Reagenzien: Kontakt der Reagenzien mit der Haut, den • Vermeiden Sie unter allen Umständen, dass es zu einer Augen oder den Schleimhäuten vermeiden. Im Falle Kontamination zwischen verschiedenen Reagenzien, eines Kontaktes sofort mit reichlich Wasser spülen, Proben und Wells kommt. ansonsten kann eine Reizung oder Verätzungen • Mikrotiterplatten-Streifen dürfen nicht wiederverwendet auftreten. werden. • Ungebrauchte Lösungen sollten gemäss den gesetzlichen Bestimmungen entsorgt werden. UNTERSUCHUNGSMATERIAL UND LAGERUNG Technische Vorsichtsmassnahmen • Der Ansatz benötigt
Nachweis von IgM-Isotypen: STANDARDISIERUNG
4f. Die Schritte 4a-4e unter Verwendung der Der Kalibrator in diesem Kit ist gegen eine interne Referenz
nachfolgenden Wells wiederholen. kalibriert, die auf 100 % Ratio eingestellt ist.
Inkubation der Proben und Waschen
5. Mikrotiterplatte mit einer Abdeckfolie abdecken und BERECHNUNG DER ERGEBNISSE
während 2 Stunden ± 5 Minuten bei 2-8 °C inkubieren Auswertung:
(Mikrotiterplatte nicht schütteln). 1. Optische Dichte aller Wells (Kalibrator, Kontrollen und
6. Abdeckfolie entfernen, die Wells entleeren und Patientenproben) bei 450 nm messen.
mindestens dreimal mit jeweils ≥300 µL kaltem 2. Falls erforderlich Mittelwert aus den Doppelmessungen
Waschpuffer waschen. Platte auf saugfähigem Papier ermitteln.
ausschlagen, um Waschpuffer vollständig zu entfernen. 3. Resultate werden als Verhältnis der Absorption der
gemessenen Probe und der Absorption des Kalibrators
Nachweis von mit IgG- und IgM-Isotypen
(Mittelwert) angegeben:
7. 100 µL Enzymmarker-IgG und IgM zu jedem Well
geben.
Absorbtion der Proben, Kontrollen
Inkubation mit Enzymmarker, Waschen und Nachweis
x 100
8. Mikrotiterplatte mit Folie abdecken und während 2 % Ratio:
Absorption des Kalibrators
Stunden ± 5 Minuten bei 2-8 °C inkubieren. Diese
Inkubation erfordert kein(!) Schütteln.
Ein Auswerteprogramm zur Ermittlung der % Ratio ist auf
9. Folie entfernen, Wells entleeren und dreimal mit jeweils den meisten Mikrotiterplatten-Readern vorhanden.
≥300 µL kaltem (2-8 °C) Waschpuffer waschen. Platte
auf saugfähigem Papier ausschlagen. Hinweis: Tabelle 4 zeigt typische Messwerte für den anti-
GM1 Autoantibodies ELISA. Die Daten dienen nur als
Wichtig: TMB-Substrat auf 18-28 °C bringen.
Beispiel. Die Absorptionswerte des Kalibrators und der
10. 100 µL TMB-Substrat zu jedem Well geben. Kontrollen müssen bei jeder Testdurchführung neu ermittelt
11. Mikrotiterplatte mit Folie abdecken und 30 ± 2 Minuten werden.
bei 18-28 °C auf einem orbitalen Mikrotiterplatten-
Schüttler bei 400-600 U/m inkubieren. Platte vor EINSCHRÄNKUNGEN
direktem Licht schützen.
12. 100 µL Stopp-Lösung zu jedem Well zugeben. • Der anti-GM1 Autoantibodies ELISA wurde nicht für
Innerhalb von 30 Minuten mit Schritt 13 fortfahren. Plasmapherese-Proben validiert.
13. Messen der optischen Dichte bei 450 nm.
REFERENZINTERVALLE UND GRENZWERT RATIO
QUALITÄTSKONTROLLE In Zusammenarbeit mit den unten aufgeführten Institutionen
haben wir den klinischen Grenzwert auf 50 % gesetzt.
Ein vollständiges Verständnis dieser Gebrauchsanleitung Werte 100
Genauigkeit von Pipetten, Temperatur- und
Tabelle 3
Zeitmessgeräten, iii) Einstellungen des Photometers und
ELISA-Washer, iv) Verfallsdaten der Reagenzien, v) 1)
Erhalten vom Blutspendezentrum der Universität Basel
2)
Erhalten vom Friedrich-Baur-Institut, der Ludwig-Maximilians-Universität
Lagerung- und Inkubations-Bedingungen, vi) die TMB-
München, Neurologie der Universität Basel und von der Neurologischen
Substratlösung sollte farblos sein, vii) Wasserreinheit. Klinik, Universität Lyon.
Release date: 2018-11-05 9/32 EK-GM1-GMLEISTUNGSMERKMALE Intra-Assay-Präzision (Within-Run): 7.0 % Die Intra-Assay-Präzision wurde aus 12 Werten von zwei IgM und/oder IgG positiven Proben im gleichen Testlauf bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 5 als % Ratio angegeben. Inter-Assay-Präzision (Run-to-Run): 11.1 % Die Inter-Assay-Präzision wurde durch die Messung von verschiedenen Serumproben mit allen drei Gangliosiden in 20 verschiedenen Testläufen bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 6 als % Ratio angegeben. Nachweisgrenze (LoB) Zwölf Tests mit Inkubationspuffer wurden im gleichen Testlauf für sämtliche Ganglioside durchgeführt. Die Nachweisgrenze, ausgedrückt als % Ratio zum Kalibrator, wurde berechnet, und liegt bei ≤5 %. Verdünnungslinearität Die Linearität des Testsystems wurde gemäss den CLSI Richtlinien EP06-A ermittelt. Das System ist linear in dem diagnostisch relevanten Bereich zwischen 20 and 100 % Ratio. Ergebnisse oberhalb von 100 % Ratio werden klinisch korrekt klassifiziert und können durch zusätzliche Verdünnungen (1:5/1:10) in den linearen Bereich hinein verdünnt werden. Spezifität Verschiedene Patientenseren mit spezifischen anti- Gangliosid- IgM und/oder IgG- Antikörper wurden über Nacht mit dem entsprechenden gelösten Antigen in verschiedenen Konzentrationen inkubiert und danach im anti-GM1 Autoantibodies ELISA getestet. Die Spezifität der Antikörperbindung für ein spezifisches Antigen wurde durch die Inhibierung mit dem entsprechenden Antigen zwischen 1 und 100 μg/mL gezeigt (Daten nicht ersichtlich). INTERFERIERENDE SUBSTANZEN Für die folgenden Substanzen wurden bis zu den aufgeführten Konzentrationen keine Interferenzen festgestellt: Triglyzeride (Intralipid®) 3000 mg/dL; Konjugiertes Bilirubin 60 mg/dL, unkonjugiertes Bilirubin 40 mg/dL oder Haemoglobin 400 mg/dL. Release date: 2018-11-05 10/32 EK-GM1-GM
FRANCAIS Réactifs Quantité Code Reconstitution
Marqueur enzymatique
DOMAINE D’UTILISATION Ac anti-IgG humaines 1 flacon B-GCO-
conjugués à HRP dans un Prêt à l’emploi
11 mL ELG
Le test anti-GM1 Autoantibodies ELISA a été conçu pour la tampon protéique avec
détermination quantitative des taux sériques d’auto- agents de conservation
anticorps IgG et IgM dirigés contre le ganglioside GM1 Marqueur enzymatique
(réf. 1-7). Ac anti-IgM humaines 1 flacon B-GCO-
conjugués à HRP dans un Prêt à l’emploi
11 mL ELM
tampon protéique avec
PRINCIPE DU DOSAGE agents de conservation
Le test anti-GM1 Autoantibodies ELISA est basé sur une Substrat TMB 1 flacon
B-TMB Prêt à l’emploi
méthode immunométrique de type “sandwich”. TMB dans un tampon citrate 11 mL
Les puits des plaques incluses dans le coffret sont coatés Solution Stop 1 flacon
B-STS
Prête à l’emploi
avec l`antigène ganglioside GM1. acide sulfurique 0.25 M 11 mL Corrosif
Les échantillons sériques à tester ainsi que le calibrateur et Tableau 1
les contrôles sont incubés dans la microplaque pendant
deux heures. Les auto-anticorps anti-GM1 présents sont STOCKAGE ET PEREMPTION DES REACTIFS
liés aux GM1 coatés sur la plaque.
Après l’élimination par lavage des composants non liés, Réactifs non ouverts / non entamés
des anticorps (Ac) dirigés contre les IgG ou IgM humaines Stables à 2-8 °C jusqu’à la date de péremption imprimée sur l’étiquette.
et conjugués à la peroxydase de raifort (HRP) sont ajoutés Réactifs ouverts / reconstitués
aux puits et la microplaque est incubée une nouvelle fois Replacer immédiatement les barrettes non
pendant deux heures. Après un second lavage, ayant pour utilisées dans le sachet en aluminium contenant
Microplaque
but d’éliminer les anticorps marqués non liés, le substrat le dessiccateur puis le refermer soigneusement.
TMB (tétraméthylbenzidine) est ajouté, induisant une Stable pendant 4 mois à 2-8 °C.
coloration bleue dont l’intensité est proportionnelle à la Tampon de lavage Stable durant 4 mois à 2-8 °C.
quantité d’auto-anticorps anti-GM1 initialement liés. La Calibrateur Stables durant 4 mois à 2-8 °C. Ne pas
réaction de coloration est arrêtée par l’ajout d’une Solution Contrôles congeler !
Stop acide faisant passer la couleur du bleu au jaune.
Tampon d’incubation
L’intensité de la coloration est déterminée par la mesure de
Marqueur Stable à 2-8 °C jusqu’à la date de péremption
l’absorption à 450 nm. L’absorbance mesurée est
enzymatique imprimée sur l’étiquette
proportionnelle à la concentration d’auto-anticorps anti-
Substrat TMB
GM1 présents dans les échantillons. Les titres sont
exprimés en % Ratio par rapport au calibrateur. Les Stable à 18-28 °C jusqu’à la date de péremption
Solution Stop
imprimée sur l’étiquette
catégories de résultats sont les suivantes : négatif, zone
grise, positif, fortement positif. Les taux d’auto-anticorps Tableau 2
anti-GM1 sont exprimés quantitativement à l’aide d’un %
Ratio du calibrateur. MATERIEL REQUIS MAIS NON FOURNI
• Pipettes de précision de 10 µL, 20 µL, 100 µL et 1000 µL
REACTIFS FOURNIS ET PREPARATION avec pointes jetables
Réactifs Quantité Code Reconstitution • Tubes en polystyrène ou polypropylène jetables, pour la
Microplaque 12 x 8 préparation des dilutions
B-GM1-MP Prête à l’emploi
Coatée (GM1) puits • Eprouvette graduée de 1000 mL pour la préparation du
Film adhésif 3 pièces tampon de lavage à partir de la solution concentrée
Tampon de lavage, • Laveur automatique de microplaques ou pissette pour le
Concentré (10x) 1 flacon A reconstituer avec
B-GCO-WB 900 mL d’eau tampon de lavage
avec agents de 100 mL déionisée
conservation • Papier absorbant
Tampon d’incubation
1 flacon
• Agitateur orbital de microplaques
avec agents de B-GCO-IB Prêt à l’emploi
100 mL • Lecteur de microplaques pour la mesure de l’absorbance
conservation
à 450 nm
Calibrateur A reconstituer avec
lyophilisé et avec agents de 1 flacon B-GCO-CA 1.5 mL de tampon
conservation d'incubation
Contrôles négatif, bas,
moyen A reconstituer avec
B-GCO-
3 flacons 1.5 mL de tampon
lyophilisés et avec agents CONSET
d'incubation
de conservation
Release date: 2018-11-05 11/32 EK-GM1-GM• Etape 11 : Bien agiter la microplaque durant l’incubation
PRECAUTIONS avec le substrat. Selon l’agitateur utilisé, il est
Précautions de sécurité recommandé d’agiter entre 400 et 600 rpm. La solution
doit s’agiter dans les puits mais sans déborder.
• Le calibrateur (B-GCO-CA) et les contrôles de cette
trousse (B-GCO-CONSET) contiennent des • Pour les laveurs automatiques, BÜHLMANN utilise le
composants d’origine humaine. Bien que les tests de mode “plate mode” c’est à dire chaque étape du
détection de l’antigène de surface du VHB et des processus (distribution) est réalisée séquentiellement
anticorps des virus VHC et VIH1/2 se soient révélés pour toutes les barrettes, avant de procéder à l’étape
négatifs, il convient de considérer les réactifs comme suivante du processus (aspiration).
capables de transmettre des maladies infectieuses, et • Les composants ne doivent pas être utilisés au-delà de
de les manipuler conformément aux bonnes pratiques la date d'expiration imprimée sur les étiquettes.
de laboratoire, en prenant les précautions appropriées. • Ne pas mélanger des réactifs de lots différents.
• Solution Stop: La Solution Stop (B-STS) contient de • Il convient de prendre toutes les précautions requises
l'acide sulfurique (0,25 M). Le réactif est irritant pour les pour empêcher toute contamination croisée entre
yeux, la peau et les muqueuses. Éviter le contact avec réactifs, entre échantillons ou entre puits.
les yeux, la peau et les vêtements. En cas de contact
avec les yeux ou la peau, laver immédiatement et • Les puits sont à usage unique.
abondamment à l’eau.
PRELEVEMENT, PREPARATION ET CONSERVATION
• Réactifs: Éviter le contact des réactifs avec la peau, les
DES ECHANTILLONS
yeux ou les muqueuses. En cas de contact, laver
immédiatement et abondamment à l’eau pour éviter tout • La procédure requiertImportant : Continuer sans interruption avec l’étape précis (bonnes pratiques de laboratoire usuelles) et en
suivante. suivant les recommandations de cette brochure.
Comme il n’existe pas de sérum de référence pour les auto-
Détermination de l’isotype IgG
anticorps anti-GM1 commercialement disponible, nous
Il est recommandé de mesurer calibrateur, contrôles et recommandons l’utilisation d’un pool de sérums positifs
échantillons en duplicata. comme référence de contrôle de qualité interne.
4a. Distribuer 100 µL de calibrateur dans le puits A1 et A2 Il est souhaitable que le calibrateur présente une valeur de
(voir figure 1). DO au moins égale à 1,2. Tous les contrôles doivent
4b. Distribuer 100 µL de contrôle moyen dans le puits B1 et présenter une valeur comprise dans les plages de mesures
B2, 100 µL de contrôle bas dans le puits C1 et C2 et établies et attendues (ratio en %). Les plages attendues des
100 µL de contrôle négatif dans le puits D1 et D2 (voir contrôles sont propres au lot et indiquées dans la fiche de
figure 1). contrôle qualité.
4c. Distribuer 100 µL de sérum dilué du patient No. 1 dans Les caractéristiques de performance devraient être
les puits E1 à E2 (voir figure 1). comprises entre les limites d’acceptabilité propres à chaque
laboratoire. Si les caractéristiques ne correspondent pas
4d. Distribuer 100 µL de sérum dilué du patient No. 2 dans
aux limites établies et que les répétitions excluent toute
les puits F1 à F2 (voir figure 1).
erreur technique, il est recommandé de contrôler les
4e. Distribuer 100 µL de sérum dilué du patient No. x à y paramètres suivants: i) Avez-vous utilisé des réactifs
dans les puits suivants (voir figure 1). réfrigérés (2-8 °C) pour les étapes 3 à 10 ? ii) pipetage,
Détermination de l’isotype IgM appareils de mesure de température et de temps, iii)
calibrage des instruments, iv) date de péremption des
4f. Répéter les étapes 4a-e en utilisant les barrettes
réactifs, v) conditions de stockage et d’incubation, vi) la
suivantes.
solution de substrat TMB devrait être incolore, vii) pureté de
Incubation de l’échantillon et lavages l’eau.
5. Couvrir la plaque à l’aide du film adhésif fourni et
incuber à 2-8 °C pendant 2 heures ± 5 minutes. Ne pas STANDARDISATION
agiter la microplaque.
Le calibrateur de la trousse a été calibré à l’aide d’une
6. Retirer le film adhésif. Vider puis laver 3 fois chaque référence interne qui a été ajustée à 100 %.
puits avec ≥300 µL de tampon de lavage réfrigéré (2-
8 °C). Vider les puits et les sécher en tapant la
RESULTATS ET CALCULS
microplaque sur du papier absorbant afin d’éliminer
complètement le tampon de lavage. Calcul des résultats
1. Mesurer l’absorbance (OD) à 450 nm de chaque puits
Détermination des isotypes IgG et IgM
(calibrateur, contrôles et échantillons de patient).
7. Ajouter 100 µL de marqueur enzymatique IgG ou IgM 2. Calculer la moyenne des duplicatas (si les mesures sont
dans les puits respectifs. réalisées en duplicata).
Incubation avec le marqueur enzymatique, lavages et 3. Les résultats sont exprimés en pourcentage de
détection l’absorbance de l’échantillon et contrôles par rapport à
8. Recouvrir la plaque à l’aide d’un nouveau film adhésif et l’absorbance moyenne du calibrateur :
incuber à 2-8 °C pendant 2 heures ± 5 minutes. Ne pas
agiter la microplaque. absorbance des échantillons, contrôles
9. Retirer le film adhésif. Vider puis laver 3 fois chaque % Ratio: x 100
puits avec ≥300 µL de tampon de lavage froid (2-8 °C). absorbance du calibrateur
Vider les puits et les sécher en tapant la microplaque
sur du papier absorbant.
La programmation de cette formule est réalisable sur la
Important : Laisser le Substrat TMB atteindre une plupart des lecteurs de microplaque.
température de 18-28 °C.
Remarque : Pour un exemple de résultats, voir tableau 4.
10. Ajouter 100 µL de Substrat TMB dans chaque puits.
Ces résultats sont donnés à titre d’exemple uniquement.
11. Recouvrir la microplaque d’un nouveau film adhésif puis Les valeurs d’absorbance du calibrateur et des contrôles
l’incuber sur un agitateur de plaque orbital à 400- doivent être déterminées pour chaque série d’échantillons
600 rpm à 18-28 °C durant 30 ± 2 minutes. Protéger la mesurée.
microplaque de la lumière directe.
12. Ajouter 100 µL de Solution Stop dans chaque puits en LIMITES
éliminant les bulles d’air à l’aide de pointes de pipettes.
Passer à l’étape 13 dans les 30 minutes suivantes. • Le test anti-GM1 Autoantibodies ELISA de BÜHLMANN
n’a pas été validé pour les échantillons de
13. Lire l’absorbance à 450 nm à l’aide d’un lecteur de
plasmaphérèse.
microplaques.
CONTROLE QUALITE
Une lecture exhaustive de ce manuel est recommandée
pour l’utilisation correcte de ce produit. Des résultats
fiables ne seront obtenus que par un travail de laboratoire
Release date: 2018-11-05 13/32 EK-GM1-GMSpécificité
INTERVALLES DES REFERENCES ET RATIOS
Différents échantillons sériques de patients présentant des
SEUILS
anticorps anti-ganglioside spécifiques, IgM et/ou IgG ont été
En accord avec les institutions mentionnées ci-dessous, incubés durant une nuit avec l’antigène soluble
nous avons établi un « cut off » (valeur seuil) clinique de correspondant en concentrations différentes et analysés
50 %. Les valeurs inférieures à 30 % doivent clairement ensuite au moyen de la procédure anti-GM1 Autoantibody
être considérées comme négatives. Les valeurs des ELISA. La spécificité des anticorps anti-gangliosides a été
rapports ont été obtenues à partir des résultats de n=100 démontrée à l'aide de tests d'inhibition par les antigènes
échantillons de donneurs de sang normaux corres-pondants employés à des concentrations
asymptomatiques (adultes de sexe masculin et féminin, comprises entre 1 et 100 µg/mL (données non reportées).
âges compris entre 18 et 70 ans) 1) et n= 277 échantillons
pathologiques2). Les sérums ont été testés pour auto- INTERFÉRENCES
anticorps anti-GM1 conformément à la procédure
d’utilisation du test. Les résultats des donneurs de sang Aucune interférence n’a été observée avec les substances
sont présentés dans le tableau 7. suivantes à la concentration indiquée : Triglycérides
(Intralipid®) 3000 mg/dL; bilirubine conjuguée 60 mg/dL,
Guide d’interprétatíon des ratios : bilirubine non conjuguée 40 mg/dL et hémoglobine
Interprétation clinique Catégorie de titres/Ratio (%) 400 mg/dL.
Négatif 50-100
Fortement positif >100
Tableau 3
1)
Recueillis au centre de dons du sang, Hôpital Universitaire de Bâle.
2)
Fournis par l’Institut Friedrich Baur de l’Université Ludwig-Maximilian de
Munich; le Département de Neurologie de l’Université de Bâle et le
Département Neurologique de l’Université de Lyon.
CARACTERISTIQUES DE PERFORMANCE
Précision Intra-essai : 7.0 %
Elle a été calculée à partir des résultats de 12 valeurs de 2
échantillons lors d’un même essai. Les résultats sont
reportés dans le tableau 5 sous forme de rapport (%)
d’après la formule citée plus haut.
Précision Inter-essais : 11.10 %
Elle a été déterminée en mesurant différents échantillons
pour les 3 gangliosides au cours de 20 essais différents.
Les résultats sont reportés dans le tableau 6 sous forme de
rapport (%) d’après la formule citée plus haut.
Limite de blanc (LoB)
12 réplicats de tampon d’incubation ont été mesurés au
cours d’un même essai. La limite de détection exprimée
en % par rapport au calibrateur se trouve ≤5 %.
Linéarité du test
Le domaine de linéarité du test a été déterminé
conformément à la directive EP06-A du CLSI. Le test est
linéaire pour des ratios compris entre 20 et 100 %, soit
dans l’intervalle diagnostique pertinent. Les ratios au-
dessus de 100 % sont correctement analysés d’un point de
vue clinique et peuvent être dilués dans le domaine de
linéarité par une dilution supplémentaire au 1:5 / 1:10.
Release date: 2018-11-05 14/32 EK-GM1-GMITALIANO Reagenti Quantità Codice Ricostituzione
Marcatore enzimatico IgG
USO PREVISTO Anticorpi Anti- IgG umane 1 flacone
coniugati con HRP in un B-GCO-ELG Pronto all’uso
11 mL
Il anti-GM1 Autoantibodies ELISA, è un test per la tampone a base proteica
determinazione quantitativa degli anticorpi IgG e IgM con conservanti
presenti nel siero umano diretti verso il ganglioside GM1 Marcatore enzimatico IgM
(rif. 1-7). Il test è concepito per la quantificazione di Anticorpi Anti- IgM umane 1 flacone
coniugati con HRP in un B-GCO-ELM Pronto all’uso
anticorpi di isotipo IgG e / o IgM. 11 mL
tampone a base proteica
con conservanti
PRINCIPIO DEL DOSAGGIO Substrato di TMB 1 flacone
B-TMB Pronto all’uso
L‘ anti-GM1 Autoantibodies ELISA si basa sulla tecnica del In tampone citrato 11 mL
dosaggio enzimatico immunometrico. I pozzetti della Soluzione bloccante 1 flacone
Pronto all’uso
micropiastra fornita sono pre-coattati con il ganglioside B-STS Agente
0.25 M di acido solforico 11 mL
corrosivo
GM1.
Il calibratore, i controlli ed i sieri dei pazienti vengono Tabella 1
incubati nei pozzetti della micropiastra e gli anticorpi anti-
GM1 (Ab) presenti vengono legati dai GM1 immobilizzati. CONSERVAZIONE E STABILITÀ DEI REAGENTI
Dopo il lavaggio delle sostanze non legate, gli anticorpi
Reagenti sigillati / non aperti
vengono rilevati con anticorpi anti IgG e/o IgM coniugati
con perossidasi di rafano (HRP). A seguito di un secondo Tutti i componenti del kit non utilizzati sono stabili a 2-8 °C fino alla data
di scadenza stampata sulle etichette.
lavaggio per eliminare il reagente anticorpo-enzima non
Reagenti Aperti / Ricostituiti
legato, viene aggiunta una soluzione di substrato
contenente tetrametilbenzidina (TMB) ai pozzetti. Si Riporre immediatamente le strip non ancora
utilizzate nella busta di alluminio che contiene
sviluppa una colorazione blu in proporzione al quantitativo Micropiastra
essiccante e risigillarle. Conservare fino a 4
di auto-anticorpi anti-GM1 legati nello step iniziale. Lo mesi a 2-8 °C.
sviluppo della colorazione viene bloccato aggiungendo una Tampone di lavaggio Conservare fino a 4 mesi a 2-8 °C.
soluzione bloccante a base di acido che trasforma la
Calibratore Conservare fino ad 4 mesi a 2-8 °C.
colorazione blu in gialla. L’intensità dell’assorbanza del
Controlli Non congelare!
colore è misurata a 450 nm.
L'assorbanza misurata è proporzionale al titolo di auto- Tampone di
anticorpi anti-GM1 presenti in un dato campione. I titoli di incubazione
Conservare a 2-8 °C fino alla data di scadenza
auto-anticorpi anti-GM1 sono espressi come rapporto Marcatore enzimatico indicata sulle etichette.
percentuale (%) di un calibratore e possono essere Substrato di TMB
assegnati a delle categorie di titolo (negativo, zona grigia, Conservare a 18-28 °C fino alla data di
Soluzione bloccante
positivo, fortemente positivo). scadenza indicata sulla etichetta.
Tabella 2
REAGENTI FORNITI E PREPARAZIONE
Reagenti Quantità Codice Ricostituzione
MATERIALI RICHIESTI MA NON FORNITI
Micropiastra 12 x 8- • Pipette di precisione con puntali monouso: 10 µL, 20 µL,
B-GM1-MP Pronta all’uso
Precoattata con GM1 pozzetti 100 µL e 1000 µL
Foglio per sigillare la • Provette di polistirene o polipropilene monouso per la
3 fogli
piastra
preparazione di diluizioni del campione
Tampone di lavaggio Diluire con 900 mL
concentrato (10x)
1 flacone
B-GCO-WB di acqua
• Cilindro da 1000 mL per la ricostituzione del tampone di
Con conservanti
100 mL deionizzata lavaggio
Tampone di incubazione 1 flacone • Dispositivo manuale o automatico per il lavaggio/
B-GCO-IB Pronto all’uso
Con conservanti 100 mL aspirazione della micropiastra
Aggiungere • Carta assorbente
Calibratore 1.5 mL di
Liofilizzato con conservanti
1 flacone B-GCO-CA
tampone di • Agitatore orbitale per micropiastra
incubazione • Lettore per micropiastra per le misurazioni
Controllo negativo, basso
Aggiungere dell’assorbanza a 450 nm
B-GCO- 1.5 mL di
e medio; Liofilizzato con 3 flaconi
CONSET tampone di
conservanti
incubazione
Release date: 2018-11-05 15/32 EK-GM1-GM• Usando dispositivi automatici per lavaggio/ aspirazione
PRECAUZIONI della micropiastra, BÜHLMANN consiglia l’utilizzo della
Precauzioni di sicurezza modalità: “plate mode”; dispensazione sequenziale in
tutte le strip e successiva aspirazione.
• Il calibratore (B-GCO-CA) ed i controlli di questo kit
(B-GCO-CONSET) contengono componenti di origine • I componenti non devono essere utilizzati dopo la data di
umana. Benché testati e risultati negativi all’antigene di scadenza riportata sulle etichette.
superficie HBV e agli anticorpi HCV e HIV1/2, i reagenti • Non miscelare reagenti appartenenti a lotti diversi.
devono essere maneggiati come potenzialmente infettivi • Fare ogni tentativo per assicurarsi che tra i reagenti, i
e secondo le buone pratiche di laboratorio utilizzando le campioni o tra i pozzetti non vi siano contaminazioni
dovute precauzioni. incrociate.
• Soluzione bloccante: La soluzione bloccante (B-STS) • I micro pozzetti non possono essere riutilizzati.
contiene acido solforico (0,25 M). Questo reagente è
irritante per gli occhi, la pelle e le mucose. Evitare il
PRELIEVO DEI CAMPIONI E CONSERVAZIONE
contatto con gli occhi, pelle e vestiario. In caso di
contatto con gli occhi o la pelle lavarsi immediatamente • La procedura richiede4b. Dispensare 100 µL del controllo medio nel pozzetto B1 CONTROLLO DI QUALITA
e B2 dispensare 100 µL del controllo basso nel pozzetto
C1 e C2 e 100 µL del controllo negativo nel pozzetto D1 La piena comprensione di questa metodica è necessaria per
e D2 (vedi figura 1). un uso ottimale del prodotto. Risultati affidabili potranno
essere ottenuti solo utilizzando tecniche di laboratorio
4c. Dispensare 100 µL del siero diluito del paziente 1 nei
precise (odierne linee guida GLP) e seguendo
pozzetti E1 - E2 (vedi figura 1).
accuratamente le istruzioni contenute in questa metodica.
4d. Dispensare 100 µL del siero diluito del paziente 2 nei Poiché disponibile in commercio non vi è nessun siero di
pozzetti F1 - F2 (vedi figura 1). controllo per gli auto-anticorpi anti-GM1 raccomandiamo
4e. Dispensare 100 µL del siero diluito del paziente x-y nei l’utilizzo di un pool di sieri positivi per i controlli di qualità
pozzetti successivi come illustrato in figura 1. interni.
Per il calibratore si raccomanda un valore OD minimo di 1.2.
Individuazione di isotipi IgM
Tutti i controlli devono rientrare negli intervalli previsti (%
4f. Ripetere i punti 4a-4e utilizzando i pozzetti successivi. rapporto). Gli intervalli previsti dei controlli sono specifici di
Incubazione e lavaggio del campione ciascun lotto e sono indicati nella scheda dati di controllo
5. Coprire la piastra con il foglio protettivo ed incubare per qualità.
2 ore ± 5 minuti a 2-8 °C. (Non occorre utilizzare Le prestazioni del dosaggio dovrebbero essere dentro i limiti
agitatore per micropiastra). stabiliti e l’accettabilità del laboratorio. Se le prestazioni non
correlano con i limiti stabiliti e la ripetizione esclude errori
6. Togliere il foglio protettivo. Svuotare i pozzetti e lavarli nella manualità, verificare quanto segue:
tre volte utilizzando almeno 300 µL di tampone di i) Avete utilizzato reagenti refrigerati (2-8 °C) durante il
lavaggio refrigerato (2-8 °C) per pozzetto. Svuotare i dispensamento (punti 3-10)? ii) accuratezza delle pipette,
pozzetti e invertire la micropiastra su carta assorbente. termometri e timer; iii) impostazioni del lavaggio nell’ELISA
Individuazione di isotipi IgG e IgM washer e del lettore ELISA; iv) Data di scadenza dei
7. Aggiungere 100 µL di marcato enzimatico a tutti i reagenti; v) Conservazione e condizioni d’incubazione; vi) La
pozzetti. soluzione di substrato TMB deve essere incolore; vii)
Purezza dell’acqua.
Incubazione con marcato enzimatici, lavaggio,
individuazione STANDARDIZZAZIONE
8. Coprire la piastra con un foglio protettivo e incubare per
2 ore ± 5 minuti a 2-8 °C (non agitare la piastra). Il calibratore incluso in questo kit è stato calibrato verso un
pool di materiale di riferimento interno. È stato aggiustato ad
9. Rimuovere il foglio protettivo. Svuotare i pozzetti e
un valore pari al 100 %.
lavare tre volte utilizzando almeno 300 µL di tampone di
lavaggio refrigerato (2-8 °C) per pozzetto. Svuotare i
pozzetti e colpire la piastra energicamente su carta RISULTATI E CALCOLO
assorbente. Calcolo dei risultati:
Importante: Lasciare che il Substrato TMB raggiunga 18- 1. Annotare l’assorbanza (OD) a 450 nm per ciascun
28 °C. pozzetto (calibratore, controlli e campioni).
10. Aggiungere 100 µL del substrato TMB ad ogni pozzetto. 2. Fare la media dei controlli in duplicato (se disponibili).
11. Sigillare la piastra con un foglio protettivo, collocare la 3. I risultati sono espressi come rapporto tra l’assorbanza
piastra su un mixer orbitale settato a 400-600 rpm, dei campioni e l’assorbanza (media) del calibratore.
proteggere la piastra dalla luce diretta ed incubare per
30 ± 2 minuti a 18-28 °C. assorbanza del campione, controlli
12. Aggiungere 100 µL di soluzione bloccante ai pozzetti. % Rapporto: x 100
Procedere al punto 13 entro 30 minuti. assorbanza del calibratore
13. Leggere l’assorbanza a 450 nm in un lettore per
micropiastra. Su molti lettori per piastra sono già presenti programmi che
calcolano direttamente i risultati in rapporto percentuale,
Importante: I risultati presentati nella tabella 4 sono esempi.
Calibratore e controlli devono essere utilizzati in ogni
singola prova.
LIMITAZIONI
• Il test anti-GM1 Autoantibodies ELISA non è stato
convalidato per i campioni ottenuti da plasmaferesi.
Release date: 2018-11-05 17/32 EK-GM1-GMINTERVALLO DI REFERENZIA E CUT-OFF INTERFERENZE In cooperazione con diversi istituti, è stato stabilito un cut- Nessuna interferenza è stata riscontrata per le seguenti off clinico del 50 %. Valori
ESPAÑOL Reactivos Cantidad Código Reconstitución
Marcador enzimático de IgG
USO PREVISTO Anticuerpo anti-IgG humana 1 vial B-GCO- Listo para usar
conjugado con HRP en un ELG
11 mL Solución verde
El enzimoinmunoanálisis anti-GM1 Autoantibodies ELISA tampón proteico con
ha sido diseñado para realizar la cuantitativa determinación conservantes
de los anticuerpos IgG e IgM de suero humano dirigidos Marcador enzimático de IgG
contra GM1 (ref. 1-7). El ha sido diseñado para la Anticuerpo anti-IgM humana 1 vial B-GCO- Listo para usar
conjugado con HRP en un
cuantificar anticuerpos de los isotipos IgG e / o IgM 11 mL ELM Solución verde
tampón proteico con
(conjugato individual IgG y IgM; 2 resultados por paciente). conservantes
Substrato TMB 1 vial
PRINCIPIOS BÁSICOS DEL ENSAYO B-TMB Listo para usar
TMB en tampón citrato 11 mL
La prueba anti-GM1 Autoantibodies ELISA se basa en la Solución de interrupción 1 vial
Listo para usar
técnica de ensayo inmunométrico enzimático. Los pocillos B- STS Agente
Ácido sulfúrico 0,25 M 11 mL
corrosivo
de la placa de microtitulación suministrada están
recubiertos con gangliósido GM1. Tabla 1
El calibrador, los controles y los sueros de paciente se
incuban en los pocillos de microtitulación, con lo que los CONSERVACIÓN Y PERÍODO DE VALIDEZ DE LOS
auto-anticuerpos anti-GM1 presentes en las muestras se REACTIVOS
unen a los gangliósidos inmovilizados. Tras un lavado para Reactivos sellados / sin abrir
retirar las sustancias no unidas, esos anticuerpos se
Todos los componentes del kit sellados/sin abrir permanecen estables a
detectan con anticuerpos frente a IgG y/o IgM humanas una temperatura de entre 2 y 8 ºC hasta la fecha de caducidad impresa
marcados con peroxidasa de rábano picante (HRP). Tras en las etiquetas.
un segundo paso de lavado en el que se retira el marcador Reactivos abiertos / reconstituidos
enzimático no unido, se añade una solución sustrato que
Devolver inmediatamente las tiras no utilizadas a la
contiene tetrametilbencidina (TMB). Se desarrolla así una bolsa de aluminio que contiene los paquetes de
coloración azul proporcional a la cantidad de auto- Placa de desecante y volver a sellar la bolsa presionando el
anticuerpos anti-GM1 unidos a los gangliósidos microtitulación mecanismo de cierre del borde en toda su longitud.
inmovilizados. El desarrollo de color se detiene añadiendo Conservar durante un periodo de hasta 4 meses
entre 2 y 8 ºC.
una solución de interrupción ácida (ácido sulfúrico diluido)
que hace virar la solución azul hacia el amarillo. Se mide Tampón de Conservar durante un periodo de hasta 4 meses
lavado entre 2 y 8 ºC.
entonces la intensidad del color a 450 nm.
Calibrador Conservar durante un periodo de hasta 4 meses
La absorbancia medida es proporcional al título de auto-
anticuerpos anti-GM1 presente en una determinada Controles entre 2 y 8 ºC. ¡No congelar!
muestra. Los títulos de auto-anticuerpos anti-GM1 se Tampón de
expresan como relaciones porcentuales con respecto al incubación
Conservar entre 2 y 8 ºC hasta la fecha de
calibrador y pueden asignarse a distintas categorías de Marcadores
caducidad impresa en las etiquetas.
título (negativo, zona gris, positivo y fuertemente positivo). enzimáticos
Sustrato TMB
REACTIVOS INCLUIDOS Y PREPARACIÓN Solución de Conservar entre 18 y 28 °C hasta la fecha de
interrupción caducidad impresa en las etiquetas.
Reactivos Cantidad Código Reconstitución
Tabla 2
Placa de microtitulación
12 x 8 B-GM1-
Previamente recubierta con Listo para usar
GM1
pocillos MP MATERIALES REQUERIDOS PERO NO
SUMINISTRADOS
Sellador de placas 3 unidades
• Pipetas de precisión con puntas desechables: pipetas de
Tampón de lavado Diluir con 900 mL 10 µL, 20 µL, 100 µL y 1000 µL
1 botella B-GCO-
concentrado de agua
100 mL WB • Tubos de poliestireno o polipropileno desechables para
Con conservantes desionizada
la preparación de diluciones de la muestra
Tampón de incubación 1 botella
B-GCO-IB Listo para usar
Con conservantes 100 mL • Probeta de 1000 mL para la reconstitución del tampón
Añadir 1,5 mL de de lavado
Calibrador B-GCO-
1 vial tampón de • Frasco lavador para el tampón de lavado o lavador de
Liofilizado con conservantes CA
incubación
placas de microtitulación automático
Controles negativo, bajo y Añadir 1,5 mL de
medio 3 viales
B-GCO-
tampón de
• Papel secante
CONSET
Liofilizados con conservantes incubación • Agitador orbital para placas de microtitulación
• Lector de placas de microtitulación para medir la
absorbancia a 450 nm
Release date: 2018-11-05 19/32 EK-GM1-GMYou can also read
