Anti-MAG anti-Myelin Associated Glycoprotein Autoantibodies ELISA - EK-MAG 96 tests - Biovendor

 
CONTINUE READING
anti-MAG
                                          anti-Myelin Associated
                                     Glycoprotein Autoantibodies
                                                          ELISA

                                                    EK-MAG          96 tests

                                                   Revision date: 2006-07-27

BÜHLMANN LABORATORIES AG
Baselstrasse 55
CH - 4124 Schönenbuch, Switzerland
Tel.: +41 61 487 1212
Fax: +41 61 487 1234
info@buhlmannlabs.ch
2
                                      ENGLISH                                                 Controls contain lot-specific amounts of anti-MAG
                                                              INTENDED USE                    antibodies. Refer to the additional control data sheet for
                                                                                              exact concentrations.
The BÜHLMANN anti-MAG ELISA is intended for
the quantitative in vitro diagnostic determination of
human IgM-autoantibodies directed against Myelin
Associated Glycoprotein (MAG) (1, 2).

                                             PRINCIPLE OF THE ASSAY
The anti-MAG autoantibodies ELISA employs the
quantitative enzymatically amplified sandwich-type
immunoassay technique. HIGHLY PURIFIED MAG
FROM HUMAN BRAIN (2) has been precoated onto a
microtiter plate. Calibrators and patient sera are
incubated for two hours in the microtiter wells and any
anti-MAG autoantibodies present are bound by the
immobilized human MAG. After washing away any
unbound substances, horseradish peroxidase (HRP)
labeled antibodies against human IgM are added to the
wells and incubated for another two hours. After a
wash step, the substrate solution containing
tetramethylbenzidin (TMB) is added to the wells and
incubated for 30 minutes. A blue coloration develops
in proportion to the amount of anti-MAG
autoantibodies bound in the initial step. The color
development is stopped by adding an acidic stop
solution (H2SO4) which turns the blue solution to
yellow. The intensity of the color absorbance is
measured in a microtiter plate reader at a wavelength
of 450 nm. The absorbance measured is directly
proportional to the concentration of anti-human MAG
autoantibodies. A set of human anti-MAG
autoantibody calibrators is used to plot a standard
curve of absorbance versus human anti-MAG
autoantibody titer units from which the concentrations
of anti-human MAG autoantibodies in the unknowns
can be calculated.

                  REAGENTS SUPPLIED AND PREPARATION
Reagents                     Quantity             Code           Reconstitution
Microtiter Plate
                             12 x 8-well strips
96 wells precoated with                           B-MAG-MP       Ready to use
                             with holder
human MAG
Plate Sealer                 3 pieces
Wash Buffer Concentrate      1 bottle                            Dilute with 900 ml of
                                                  B-MAG-WB
(10x)                        100 ml                              deionized water
Incubation Buffer            1 bottle
                                                  B-MAG-IB       Ready to use
with preservatives           100 ml
Calibrators A to D1
                                                                 Add 1 ml of
Human serum with             4 vials              B-MAG-CASET
                                                                 Incubation Buffer
preservatives
Low and High Control2
                                                                 Add 1 ml of
Human serum with             2 vials              B-MAG-CONSET
                                                                 Incubation Buffer
preservatives
Enzyme Label IgM
Anti-human IgM antibody      1 vial                              Ready to use
conjugated to HRP in a                            B-MAG-ELM
                             11 ml                               Blue solution
protein-based buffer with
preservatives
TMB Substrate
                             1 vial
TMB in Citrate buffer with                        B-TMB          Ready to use
                             11 ml
Hydrogen Peroxide
Stop Solution                1 vial                              Ready to use
                                                  B- STS
0.25 M Sulfuric acid         11 ml                               Corrosive agent
                                                                                Table 1
1
    After reconstitution, Standards A, B, C and D contain
    70000, 15000, 3000 and 1000 Bühlmann Titer Units
    (BTU) of anti-MAG antibodies, respectively.
Revision date:       2006-07-27                                                    2/32                                        BÜHLMANN anti-MAG ELISA
STORAGE AND SHELF LIFE OF REAGENTS                              plain tubes, avoid hemolysis, leave to clot for one hour
Unopened Reagents                                                                  at RT (18-28°C), centrifuge for 15 minutes at
Store at 2-8°C. Do not use past kit expiration date printed on the label.          approximately 1800 x g at RT and collect the serum.
Opened / Reconstituted Reagents                                                    Store serum samples at ≤-20°C. Samples are stable for
                        Return unused strips immediately to the foil pouch
                        containing the desiccant packs and reseal along the
                                                                                   ≥1 year if stored at ≤-20°C. Avoid repeated freeze-
Microtiter Plate
                        entire edge of zip-seal. Store for up to 2 months at       thaw cycles. Frozen samples should be thawed and
                        2-8°C.
                                                                                   mixed thoroughly by gentle swirling or inversion prior
Wash Buffer diluted     Store for up to 2 months at 2-8°C.
                                                                                   to use.
Calibrators
                        Store for up to 2 months at -20°C.
Controls
Incubation Buffer                                                                                                    ASSAY PROCEDURE
Enzyme Label IgM                                                                   1. Dilute all patient samples 1:1000 with Incubation
                        Store at 2-8°C until expiration date.
TMB Substrate                                                                         Buffer (e.g. 2 µl of serum + 2 ml of Incubation
(protect from light)
                                                                                      Buffer). Allow diluted samples to set for one hour at
Stop Solution           Store at 18-28°C until expiration date.
                                                                       Table 2        18-28°C vortex from time to time. Put samples for
                                                                                      10 minutes on ice prior to pipetting in step 4c.
                                 WARNINGS AND PRECAUTIONS                          2. Prepare a plate with sufficient strips to test the
Calibrators (B-MAG-CASET) and Controls (B-MAG-                                        desired number of calibrators, controls and samples.
CONSET) of this kit contain components of human                                       Remove excess strips from the holder and reseal
origin. Each serum donor unit used in the preparation                                 them in the foil pouch together with the desiccant
of the kit components was tested by an FDA approved                                   packs without delay. Store refrigerated.
method and found negative for HBV surface antigen,                                 Important: Use refrigerated reagent solutions in
so as for HCV and HIV1/2 antibodies. Although these                                steps 3. to 9.
methods are highly accurate, there is no guarantee that                            3. Wash the coated wells four times using at least 300
this material cannot transmit Hepatitis or AIDS.                                      µl of refrigerated Wash Buffer per well. Empty the
Therefore, all patient specimens and kit components                                   wells and strike the plate firmly onto blotting
should be handled as if capable of transmitting                                       paper.
infections. All products containing human source                                   4a.     Pipet 100 µl of Incubation Buffer (as blank) in
material should be handled in accordance with good                                    duplicate into wells A1+A2.
laboratory practice using appropriate precautions.                                    Pipet 100 µl of Calibrator A in duplicate into wells
Substrate and Stop Solution: The Substrate Solution                                   B1+B2.
(B-TMB) contains Tetramethylbenzidine (TMB),                                          Pipet 100 µl of Calibrator B in duplicate into wells
hydrogen peroxide and dimethylformamide. The Stop                                     C1+C2.
Solution (B-STS) contains sulfuric acid. Each of those                                Pipet 100 µl of Calibrator C in duplicate into wells
reagents is irritant to eyes, skin and mucous                                         D1+D2.
membranes. Avoid contact with eyes, skin and                                          Pipet 100 µl of Calibrator D in duplicate into wells
clothing.                                                                             E1+E2.
                                                                                   4b.     Pipet 100 µl of the Low Control in duplicate
              MATERIALS REQUIRED BUT NOT PROVIDED                                     into wells F1+F2.
•  Precision pipettes with disposable tips: 2 µl, 100                                 Pipet 100 µl of the High Control in duplicate into
 µl and 1 ml pipettes.                                                                wells G1+G2.
• Disposable polystyrene or polypropylene tubes for                                4c.     Pipet 100 µl of each diluted sample in
 the preparation of sample dilutions.                                                 duplicate into the subsequent wells.
                                                                                   5. Cover the plate with a Plate Sealer and incubate for
• 1000 ml cylinder for the dilution of the Wash
                                                                                      2 hours (± 5 min) at 2-8°C.
 Buffer Concentrate.
                                                                                   6. Remove and discard the Plate Sealer. Empty the
• Microtiter plate washer or squeeze bottle for Wash
                                                                                      wells and wash four times using at least 300 µl of
 Buffer.
                                                                                      refrigerated Wash Buffer per well. Empty the
• Microtiter plate rotator.                                                           wells and strike the plate firmly onto blotting
• Microtiter plate reader for measurement of                                          paper.
 absorbance at 450 nm.                                                             7. Add 100 µl of Enzyme Label IgM to all wells.
                                                                                   8. Cover the plate with a Plate Sealer and incubate for
                    SPECIMEN COLLECTION AND STORAGE
                                                                                      2 hours (± 5 min) at 2-8°C.
The procedure calls for
wells and strike the plate firmly onto blotting                                                        RESULTS
   paper.                                                  Standard Curve
Important: Allow TMB substrate solution to reach           •    Record the absorbance at 450 nm for each
18-28°C.                                                     calibrator.
10.     Add 100 µl of the TMB Substrate Solution to        •    Average the duplicate values.
   each well.                                              •    Plot the average absorbance values (vertical y-axis)
11.     Cover the plate with a Plate Sealer, place the       versus BTU (see next chapter) of the calibrators
   plate on a plate mixer set at 800-1000 rpm, protect       (horizontal x-axis) using a lin/log graph paper.
   the plate from direct light and incubate for 30         •      Draw the best fitting curve or calculate the
   minutes (± 5 min) at 18-28°C.                             standard curve using a spline smoothed fitting
12.     Add 100 µl of Stop Solution to all wells.            algorithm.
   Remove air bubbles with a pipette tip. Proceed to       Samples and Controls
   step 13. within 30 minutes.                             •    Record the absorbance at 450 nm for each sample
13.     Read the absorbance at 450 nm in a microtiter        and control well.
   plate reader. If wavelength correction is available,    •    Average the duplicate values.
   set instrument to dual wavelength measurement at        •    Locate the absorbance values of the samples and
   450 nm with background wavelength correction set          controls on the vertical axis, draw a horizontal line
   at 600 or 620 nm.                                         intersecting the standard curve and read from the
                                                             horizontal axis.
                                                           NOTE: If the microtiter plate reader is not capable of
                                                           reading absorbance greater than 2 or greater than the
                                                           absorbance of the highest calibrator (Calibrator A), a
                                                           second reading at a wavelength of 490 or 492 nm is
                                                           recommended (reference filter at 600 or 620 nm if
                                                           available). In this case, proceed to construct a second
                                                           standard curve with the absorbance readings of all
                                                           calibrators at 490 or 492 nm. The concentration of the
                                                           off-scale samples at 450 nm are then read from the new
                                                           standard curve as described above. The readings at 490
                                                           or 492 nm should not replace the on-scale readings at
                                                           450 nm.
                                                           Examples of Results and of Standard Curve (see
                                                           Table 11 and Figure 1)
                                                           These results and standard curve are provided for
                                                           demonstration purposes only. A standard curve must
                                                           be generated for each set of samples to be assayed.

                                                                      CUT-OFF VALUES AND STANDARDIZATION
                                                           The frequency of anti-MAG antibodies in normal
                                                           human sera was determined using blood samples from
                                                           asymptomatic volunteer blood donors (adult men and
                                                           women at the age of 18 to 70 years). 150 samples
                                                           were assayed according to the assay procedure and the
                                                           results listed in Table 12 were obtained.
                                                           NOTE: These titer ranges should be used as guidelines
                                                           only. It is recommended that each laboratory
                                                           establishes its own expected ranges for its patient
                                                           population.
                                                           Proposed Cut-off Titer
                                                           The mean + 3SD results in a technical cut-off value of
                                                           729 BTU. For practical reasons, we recommend to use
                                                           a CUT-OFF VALUE OF 1000 BTU, corresponding to
                                                           the lowest calibrator (= Calibrator D) in the standard
                                                           curve.
                                                           Standardization
                                                           The calibrators of the BÜHLMANN anti-MAG
                                                           ELISA kit were calibrated against an internal
Revision date:   2006-07-27                         4/32                                     BÜHLMANN anti-MAG ELISA
Reference Pool. The Reference Pool consists of more            subsequently assayed according to the assay procedure
than 10 human sera containing low, medium and high             (cf. Table 15). It is suggested that the relatively high
titers of anti-MAG antibodies, respectively. Titers and        deviation in about 50% of the samples is due to
specificity of each serum in the reference pool were           antibody aggregations. In general, pathological sera
first analyzed by anti-MAG immunoblots.                        show strongly elevated titer of autoantibodies
The Bühlmann Titer Units (BTU) were established                therefore it has no influence to the positive/negative
as follows:                                                    discrimination.
• Normal donor samples were assayed according to               Analytical Sensitivity: 444 BTU. 20 duplicates of
  the anti-MAG ELISA assay procedure.                          incubation buffer were assayed in a single run. Mean
•     Serially diluted samples of the Reference Pool were      and standard deviation were calculated for the
    assayed in the same run.                                   absorbance values. The minimal detectable dose of
•   The dilution at which the Reference Pool sample            anti-MAG antibodies was calculated to be 444 BTU
 falls short of the cut-off corresponds to the titer of the    by adding two standard deviations to the mean
 reference pool.                                               absorbance and intersecting this value with the
NOTE: Serum titer values depend on the assay method            standard curve obtained in this run.
and, in particular, on the specificity and the cut-off         Functional sensitivity: 900 BTU. 20 duplicates of
values established with an individual assay method.            low titer anti-MAG autoantibodies were assayed in a
Therefore, titer values obtained with different methods        single run. Mean, standard deviation (SD) and
cannot be compared directly.                                   coefficient of variation (CV) were calculated from the
                                                               absorbance values. We found a titer of 900 BTU with
                                      QUALITY CONTROL
                                                               a CV less than 10%.
A thorough understanding of this package insert is
necessary for the successful use of the product.               Specificity: Four sets of experiments were performed
Reliable results will be obtained only by using precise        to assess the specificity of the BÜHLMANN anti-
laboratory techniques (current GLP guidelines) and             MAG ELISA:
accurately following this package insert.                      1. NEUTRALIZATION OF ANTI-MAG AUTOANTIBODIES:
Since there is no control serum for anti-MAG                   Five sera with high anti-MAG titers could be inhibited
antibodies commercially available, we recommend to             from binding to the microtiter plates coated with MAG
use a positive serum pool for internal quality controls.       in a concentration-dependent manner when
All controls must fall within established confidence           preincubated for one hour with Incubation Buffer
limits. The confidence limits for the Controls are lot-        supplemented with 1 to 200µg/ml of MAG prior to
specific and printed on the additional data sheet.             testing in the ELISA.
The reproducibility of standard curve parameters and           2. SPECIFICITY OF ANTI-MAG AUTOANTIBODY BINDING:
control values should be within established limits of          Five sera with medium to high anti-MAG
laboratory acceptability. If the precision of the assay        autoantibody titers and five negative sera were tested
does not correlate with the established limits and             on a GanglioCombi (EK-GCO) plate coated with
repetition excludes errors in technique, check the             asialo-GM1, GM1, GM2, GD1a, GD1b and GQ1b.
following issues: i) pipetting, temperature controlling        None of the sample showed ratio higher than 10%
and timing devices ii) ELISA reader settings iii)              (Cut-off ratio >12%). Similarly, six sera with high anti-
expiration dates of reagents iv) storage and incubation        Ganglioside autoantibody titers (see above) and five
conditions v) TMB Substrate Solution should be                 negative sera, were tested on plates coated with MAG.
colorless vi) purity of water.                                 None of these disease state sera gave a signal higher
                                                               than 300 BTU.
                      PERFORMANCE CHARACTERISTICS              3. COMPARISON TO IMMUNOBLOT (WESTERN BLOT): 127
                                                               patient sera (40 female; 87 male; age 4-90 years) with
Intra-Assay Precision (Within-Run): 6.5%. The
                                                               neurological diseases suspectedly caused by anti-
intra-assay precision was calculated from the results of
                                                               MAG autoantibodies were tested by the ELISA and a
20 pairs of values obtained in a single run (cf. Table
                                                               western blot method, respectively. MAG isolated
13).
                                                               from human central nervous system (CNS) was used
Inter-Assay Precision (Run-to-Run): 15.4%. The                 in both methods. All 12 sera showing medium to very
inter-assay precision was calculated from the results of       high titers of anti-MAG IgM autoantibodies in the
20 pairs of values obtained in 20 different runs (cf.          ELISA procedure were also clearly positive when
Table 14).                                                     analyzed on immunoblots. 114 out of 115 sera
Dilution Linearity/Parallelism: 147%. 7 human                  showing anti-MAG IgM antibody titers below the
serum samples containing high titer of anti-MAG                ELISA cut-off value were also negative when
antibodies were diluted with Incubation Buffer 1:1000          analyzed on immunoblots, whereas 1 serum was
to 1:64000, left for one hour at 18-28°C and
Revision date:   2006-07-27                             5/32                                     BÜHLMANN anti-MAG ELISA
slightly positive by the immunoblot method only (F.                                     ČESKY
Ferracin and A.J. Steck, unpublished results).                                                                         POUŽITÍ
4. COMPARISON TO INDIRECT IMMUNOFLUORESCENCE            Souprava anti-MAG ELISA firmy BÜHLMANN je
ASSAY (IFA): Sera from 150 patients (unknown sex        určena pro kvantitativní in vitro diagnostické
and age) diagnosed as having IgM monoclonal             stanovení IgM autoprotilátek proti glykoproteinu
gammopathies were tested by the ELISA and an IFA        asociovanému s myelinem (Myelin Associated
method, respectively. In the IFA method, sera were      Glycoprotein -MAG) (1, 2).
incubated on frozen and aceton-fixed monkey sciatic
nerve sections and bound anti-MAG antibodies were                                                            PRINCIP METODY
detected by FITC-labeled anti-human IgM antibody.       Test ELISA na autoprotilátky proti MAG je
26 patients (17.3%) were positive and 115 patients      imunometrickou enzymovou sendvičovou reakcí
(76.7%) were negative in both methods, whereas 5        v pevné fázi. Mikrotitrační destička je potažena
sera (3.3%) were positive in the IFA method only and    VYSOCE PURIFIKOVANÝM LIDSKÝM MAG ANTIGENEM
4 sera (2.7%) were only positive in the ELISA           (2) s nejvyšší specificitou a senzitivitou. Kalibrátory,
method, respectively (3).                               kontroly a vzorky séra se inkubují dvě hodiny (2-
                                                        8°C)v mikrotitračních kyvetách a veškeré přítomné
                                                        autoprotilátky proti MAG se navážou na
                                                        imobilizovaný lidský MAG. Po vymytí všech
                                                        nenavázaných substancí se do kyvet přidají protilátky
                                                        proti lidskému IgM značené křenovou peroxidázou
                                                        (HRP) a proběhne další inkubace po dobu 2 hodin (2-
                                                        8°C). Po dalším promytí se přidá substrát obsahující
                                                        tetrametylbenzidin (TMB) a inkubuje se 30 minut.
                                                        Dojde k modrému zbarvení, které je úměrné množství
                                                        autoprotilátek navázaných v prvním kroku. Barvení se
                                                        ukončí přidáním kyselého zastavovacího roztoku
                                                        (H2SO4), který změní modrý roztok na žlutý.
                                                        Absorbance změřená při vlnové délce 450 nm je
                                                        přímo úměrná koncentraci autoprotilátek ve vzorku.
                                                        Sada kalibrátorů pro autoprotilátky proti MAG slouží
                                                        k vytvoření kalibrační křivky, pomocí níž je možné
                                                        vypočítat koncentraci vzorku.
                                                                               DODÁVANÉ REAGENCIE A PŘÍPRAVA
                                                                                                    Katalogové
                                                              Reagencie             Množství                      Rekonstituce
                                                                                                       číslo
                                                        Mikrotitrační destička 12 x 8 - kyvet s   B-MAG-MP       Připravená k použití
                                                        potažená lidským MAG   držákem
                                                        Krycí fólie              3 ks
                                                        Koncentrát
                                                        promývacího pufru                                        Nařeďte 900 ml
                                                                                 1 lahvička
                                                        (10x)                                     B-MAG-WB       deionizované
                                                                                 100 ml
                                                        S konzervačními                                          vody
                                                        látkami
                                                        Inkubační pufr
                                                                                 1 lahvička                      Připravený k
                                                        s konzervačními                           B-MAG-IB
                                                                                 100 ml                          použití
                                                        prostředky
                                                                          1
                                                        Kalibrátory A až D
                                                                                                              Přidejte 1 ml
                                                        Lidské serum s
                                                                                 4 ampule         B-MAG-CASET inkubačního
                                                        konzervačními
                                                                                                              pufru
                                                        prostředky
                                                        Kontrolní sérum
                                                        vysoká/nízká hladina
                                                        2                                                        Přidejte 1 ml
                                                                                                  B-MAG-
                                                                                 2 ampule                        inkubačního
                                                        Lidské serum s                            CONSET
                                                                                                                 pufru
                                                        konzervačními
                                                        prostředky
                                                        Enzymový marker
                                                        IgM
                                                        Protilátka proti
                                                                                 1 ampule                        Připravený k
                                                        lidskému IgM
                                                                                                  B-MAG-ELM      použití
                                                        konjugovaná s HRP v      11 ml
                                                                                                                 Modrý roztok
                                                        proteinovém pufru s
                                                        konzervačními
                                                        prostředky
                                                        Substrát TMB                                             Připravený k
                                                                                 1 ampule
                                                        TMB v citrátovém pufru                    B-TMB          použití
                                                                                 11 ml
                                                        s peroxidem vodíku
                                                        Zastavovací roztok       1 ampule         B- STS         Připravený k

Revision date:   2006-07-27                      6/32                                                BÜHLMANN anti-MAG ELISA
0.25 M kyselina sírová   11 ml               použití                              SKLADOVÁNÍ A TRVANLIVOST REAGENCIÍ
                                             Korozivní láka
                                                     Tabulka 1                                Neotevřené reagencie
1
    Po rekonstituci obsahují kalibrátory A, B, C a D 70000,      Skladujte při 2-8°C. Nepoužívejte po uplynutí expirace.
    15000, 3000 resp. 1000 titračních jednotek Bühlmann          Otevřené / rekonstituované regencie
    (Bühlmann Titer Units - BTU) protilátek proti MAG.                                    Nepoužívané proužky vraťte ihned do sáčku se sušidlem
2
    Množství protilátek proti MAG obsažené v kontrolách          Mikrotitrační destička   a uzavřete zip po celé délce. Skladujte při teplotě 2-8°C
    závisí na šarži. Přesné údaje o koncentracích najdete v                               do expirace.
                                                                 Promývací pufr           Skladujte nejvýše 2 měsíce po rekonstituci při teplotě 2-
    příslušném příbalovém letáku.
                                                                 naředěný                 8°C.
                                                                 Kalibrátory
                                                                                          Skladujte nejvýše 2 měsíce při teplotě -20°C.
                                                                 Kontroly
                                                                 Inkubační pufr
                                                                 Enzymový marker
                                                                 IgM                   Skladujte při teplotě 2-8°C do expirace.
                                                                 Substrát TMB (chraňte
                                                                 před světlem)
                                                                 Zastavovací roztok    Skladujte při teplotě 18-28°C do expirace.
                                                                                                                                          Tabulka 2

                                                                                BEZPEČNOSTNÍ UPOZORNĚNÍ A OPATŘENÍ
                                                                 Kalibrátory (B-MAG-CASET) a kontroly (B-MAG-
                                                                 CONSET) v této soupravě obsahují komponenty
                                                                 lidského séra. Každé sérum použité pro přípravu této
                                                                 soupravy bylo testováno metodami schválenými FDA
                                                                 a shledáno negativním na povrchový antigen HBV a
                                                                 protilátky proti HCV a HIV1/2 . Přestože tyto metody
                                                                 jsou vysoce přesné, neexistuje záruka, že tento
                                                                 materiál nemůže přenášet hepatitidu nebo AIDS.
                                                                 Proto se všemi pacientskými vzorky a komponenty
                                                                 soupravy musí být nakládáno, jako by byly
                                                                 potenciálně infekční. Se všemi výrobky obsahujícími
                                                                 lidský materiál je nutno nakládat v souladu s dobrou
                                                                 laboratorní praxí při dodržení všech bezpečnostních
                                                                 opatření.
                                                                 Substrát a zastavovací roztok: Substrát (B-TMB)
                                                                 obsahuje tetrametylbenzidin (TMB), peroxid vodíku a
                                                                 dimetylformamid. Zastavovací roztok (B-STS)
                                                                 obsahuje kyselinu sírovou. Tyto látky dráždí oči, kůži a
                                                                 sliznice. Vyvarujte se kontaktu s očima, kůží a oděvem.

                                                                     POTŘEBNÉ LABORATORNÍ VYBAVENÍ A POMŮCKY
                                                                 •   Přesné pipety se špičkami na jedno použití: 2 µl,
                                                                  100 µl a 1 ml.
                                                                 • Polystyrenové nebo polypropylenové zkumavky
                                                                  na jedno použití pro ředění vzorku.
                                                                 • Odměrný válec 1000 ml pro naředění promývacího
                                                                  pufru.
                                                                 • Myčka miktrotitračních destiček nebo stříkací
                                                                  láhev na promývací pufr.
                                                                 • Rotátor na mikrotitrační destičky.
                                                                 • Fotometr na mikrotitrační destičky s optickým
                                                                  filtrem (450 nm).

                                                                                                 ODBĚR A SKLADOVÁNÍ VZORKU
                                                                 Množství vzorku potřebné pro toto stanovení je
obyčejných zkumavek tak, aby nedošlo k hemolýze,         8. Přikryjte destičku fólií a nechejte inkubovat
promíchejte několikerým převrácením zkumavky a              2 hodiny (± 5 min) při teplotě 2-8°C.
nechejte vysrážet jednu hodinu při pokojové teplotě      10. Odstraňte fólii. Vyprázdněte kyvety a vymyjte je
(18-28°C). Proveďte centrifugaci při 1800 x g po dobu       chlazeným promývacím pufrem, a to čtyřikrát,
15 minut při pokojové teplotě (18-28°C) a odeberte          vždy nejméně 300 µl na každou kyvetu.
sérum.                                                      Vyprázdněte kyvety a důkladně vysušte
Uchovávejte vzorky zamražené na teplotu ≤-20°C. Při         vyklepáním na savý papír.
této teplotě jsou vzorky stabilní po dobu ≥1 rok.        Důležité: Nechejte substrát TMB vytemperovat na
Vyvarujte se opakovaného rozmrazení a zmrazení           teplotu 18-28°C.
vzorku. Zmražené vzorky se musí nechat rozpustit a       10.     Do všech kyvet přidejte 100 µl substrátu TMB.
před použitím řádně promíchat jemným kroužením           11.     Přikryjte destičku fólií, umístěte ji na rotátor
nebo převracením.                                           nastavený na 800–1000 rpm, a nechejte inkubovat
                                                            30 minut (± 5 min) při teplotě 18-28°C. Přitom
                                     POSTUP MĚŘENÍ          destičku chraňte před přímým světlem.
3. Nařeďte všechny vzorky inkubačním pufrem v            12.     Do všech kyvet přidejte 100 µl zastavovacího
   poměru 1:1001 (např. 2 µl séra + 2 ml inkubačního        roztoku. Špičkou pipety odstraňte vzduchové
   pufru). Nechejte naředěné vzorky hodinu stát při         bubliny.
   teplotě 18-28°C, s občasným promícháním (Vortex).     13.     Do 30 minut změřte absorbanci při 450 nm.
   Před pipetováním, viz krok 4c, dejte vzorky na 10        Doporučujeme provést bichromatické měření
   minut na led.                                            s vlnovou délkou referenčního filtru 600 - 620 nm.
4. Připravte si destičku s dostatečným počtem proužků
   k testování požadovaného počtu kalibrátorů, kontrol
   a vzorků. Zbývající proužky ihned vraťte do sáčku
   se sušidlem. Uložte v chladu.
Důležité: V krocích 3 až 9 používejte chlazené
reagencie (2-8°C).
3. Vymyjte mikrokyvety chlazeným promývacím
   pufrem, a to čtyřikrát, vždy nejméně 300 µl na
   každou kyvetu. Vyprázdněte kyvety a důkladně
   vysušte vyklepáním na savý papír.
4a.     Napipetujte dvakrát 100 µl inkubačního pufru
   (blank) do kyvet A1+A2.
Napipetujte dvakrát 100 µl kalibrátoru A do kyvet
   B1+B2
   Napipetujte dvakrát 100 µl kalibrátoru B do kyvet
   C1+C2.
   Napipetujte dvakrát 100 µl kalibrátoru C do kyvet
   D1+D2.
   Napipetujte dvakrát 100 µl kalibrátoru D do kyvet
   E1+E2.
4b.     Napipetujte dvakrát 100 µl nízké hladiny
   kontroly do kyvet F1+F2.
   Napipetujte dvakrát 100 µl vysoké hladiny kontroly
   do kyvet G1+G2.
4c.     Napipetujte vždy dvakrát 100 µl naředěného
   vzorku séra do dalších kyvet.
5. Přikryjte mikrotitrační destičku fólií a nechejte
   inkubovat 2 hodiny (± 5 min) při teplotě 2-8°C.
6. Odstraňte fólii. Vyprázdněte kyvety a vymyjte je
   chlazeným promývacím pufrem, a to čtyřikrát,
   vždy nejméně 300 µl na každou kyvetu.
   Vyprázdněte kyvety a důkladně vysušte
   vyklepáním na savý papír.
7. Do všech kyvet přidejte 100 µl enzymového
   markeru IgM.

Revision date:   2006-07-27                       8/32                                     BÜHLMANN anti-MAG ELISA
VÝSLEDKY       Standardizace
Kalibrační křivka                                              Kalibrátory soupravy anti-MAG ELISA firmy
•    Pro všechny kalibrátory změřte absorbanci při 450         BÜHLMANN byly kalibrovány vůči internímu
  nm.                                                          referenčnímu materiálu. Referenční materiál se skládá
•    Vypočítejte průměr z duplikovaných hodnot                 z více než 10 vzorků lidského séra obsahujících nízké,
  absorbancí kalibrátorů.                                      střední resp. vysoké titry protilátek proti MAG. Titry a
•    Vyznačte průměrné hodnoty absorbance kalibrátorů          specificita každého séra v referenčním materiálu byly
  (svislá osa y) proti BTU (viz následující kapitola)          analyzovány imunobloty Anti-MAG.
  kalibrátorů (vodorovná osa x) s použitím                     Titrační jednotky Bühlmann (BTU) byly stanoveny
  semilogaritmického papíru.                                   následujícím způsobem:
•       Zakreslete kalibrační křivku nebo vypočítejte          • Vzorky normálních dárců byly analyzovány
  spline-funkci s použitím algoritmu „spline smoothed            metodou anti-MAG ELISA.
  fitting“.                                                    • Sériově ředěné vzorky interního referenčního
Vzorky a kontroly                                                materiálu byly stanoveny v jednom měření.
•   Pro každou kyvetu se vzorkem a kontrolou změřte            • Ředění, při němž je hodnota příslušného
  absorbanci při 450 nm.                                         referenčního vzorku již pod hodnotou cut-off
•   Vypočítejte průměr z duplikovaných hodnot.                   stanovenou předtím na základě normálních vzorků,
•   Koncentraci ve vzorku zjistíte pomocí kalibrační             odpovídá titru referenčního vzorku v jednotkách
  křivky .                                                       BTU.
POZNÁMKA: Jestliže fotometr není schopen                       POZNÁMKA: Titr séra závisí na použité metodě a
detekovat absorbanci vyšší než 2 nebo vyšší než je             zvláště na specificitě a hodnotě cut-off stanovené pro
absorbance nejvyššího kalibrátoru , doporučujeme               danou metodu. Nelze proto vzájemně porovnávat
provést další měření při vlnové délce 490 nebo 492             hodnoty titru získané s použitím různých metod.
nm (případný referenční filtr při 600 nebo 620 nm).
V takovémto případě musíte vytvořit druhou kalibrační                                             KONTROLA KVALITY
křivku s absorbancí všech kalibrátorů při 490 nebo 492         Pro správné použití výrobku je nezbytné prostudování
nm. Koncentrace vzorků, které při 450 nm byly mimo             tohoto příbalového letáku. Spolehlivé výsledky získáte
rozmezí, se pak stanovují z této nové kalibrační křivky.       pouze při dodržení přesných laboratorních postupů
Hodnoty stanovené při 490 nebo 492 nm nenahrazují              (běžné směrnice GLP – dobrá laboratorní praxe) a
hodnoty ostatních vzorků stanovené při 450 nm.                 přesným dodržením tohoto návodu.
Příklady    výsledků          a   kalibrační   křivky   (viz   Protože na trhu není běžně dostupné kontrolní sérum
Table 11 a Figure 1)                                           pro protilátky proti MAG, doporučujeme pro interní
Uvedené výsledky a kalibrační křivka slouží pouze              kontrolu kvality použít pozitivní směsná séra.
jako příklad. Kalibrační křivku je nutné vytvořit pro          Výsledky všech naměřených kontrol musí být
každou sadu měřených vzorků.                                   v předepsaných rozmezích. Limity spolehlivosti
                                                               kontrol jsou specifické pro šarži a najdete je vždy
                  HODNOTY CUT-OFF A STANDARDIZACE              v příbalovém letáku kontrol.
Výskyt protilátek proti MAG v normálním lidském                Reprodukovatelnost parametrů kalibrační křivky a
séru byl zjišťován na vzorcích krve od                         výsledků kontrol musí být v rámci stanovených limitů
asymptomatických dobrovolných dárců krve (dospělí              přijatelnosti pro laboratoř. Jestliže přesnost stanovení
muži i ženy ve věku 18 až 70 let). Touto metodou bylo          neodpovídá stanoveným limitům a opakované měření
změřeno 150 vzorků a výsledky jsou uvedeny v Table             vyloučí technickou závadu, je nutné zkontrolovat
12.                                                            následující: i) pipetování, přístroje měřící teplotu a
POZNÁMKA:             Tyto rozsahy titru slouží pouze          čas, ii) kalibrace fotometru, iii) expirace reagencií, iv)
jako informativní hodnoty. Doporučujeme, aby si                podmínky skladování a inkubace, v) substrát TMB
každá laboratoř vytvořila svá vlastní rozmezí, která           musí být bezbarvý, vi) čistota vody.
odpovídají místní populaci.
Doporučená hodnota cut off                                                                             ZNAKY METODY
Střední hodnota + 3SD udává jako technický cut-off             Přesnost v rámci stanovení: 6,5%. Přesnost v rámci
hodnotu 729 BTU. Z praktických důvodů                          stanovení byla vypočítána z výsledků 20 dvojic
doporučujeme použít jako HODNOTU CUT-OFF 1000                  hodnot získaných z jednoho měření (viz Table 13).
BTU jako pozitivní koncentraci, která odpovídá
                                                               Přesnost mezi stanoveními : 15,4%. Přesnost mezi
nejnižšímu kalibrátoru (= Kalibrátor D) v kalibrační
                                                               stanoveními byla vypočítána z 20 dvojic výsledků 20
křivce.
                                                               různých měření (viz Table 14).
                                                               Linearita ředění: 147%. 7 vzorků lidského séra
                                                               obsahujících vysoký titr protilátek proti MAG bylo
Revision date:   2006-07-27                             9/32                                      BÜHLMANN anti-MAG ELISA
naředěno inkubačním pufrem v poměru 1:1001 až                metody ELISA bylo negativních i při stanovení
1:64001, ponecháno 1 hodinu při teplotě 18-28°C a            metodou imunoblot a 1 sérum bylo mírně pozitivní
poté změřeno (viz. Table 15). Předpokládáme, že              pouze u metody imunoblot (F. Ferracin a A.J. Steck,
poměrně vysoké odchylky vzorků (přibližně 50%)               nepublikované výsledky).
jsou způsobeny agregací protilátek. Patologická séra         4. SROVNÁNÍ S NEPŘÍMÝM IMUNOFLUORESCENČNÍM
obecně vykazují silně zvýšené titry autoprotilátek,          STANOVENÍM (IFA): Vzorky séra 150 pacientů
tento jev nemá tedy žádný vliv na rozhodování                (neznámého pohlaví a věku) s diagnózou IgM
pozitivní/negativní.                                         monoklonální gamapatie byly testovány metodou
Analytická senzitivita: 444 BTU. Bylo stanoveno 20           ELISA a IFA. Při stanovení IFA se vzorky
dvojic inkubačního pufru v jednom měření. Pro                inkubovaly na zmražených a acetonem fixovaných
hodnoty absorbancí byla vypočítána střední hodnota a         řezech opičího sedacího nervu a navázané
standardní odchylka. Minimální zjistitelné množství          autoprotilátky proti MAG byly detekovány
protilátek proti MAG bylo stanoveno na 444 BTU tak,          protilátkou proti lidskému IgM značenou FITC. 26
že ke střední hodnotě absorbance se přičetl                  vzorků (17,3%) bylo pozitivních a 115 vzorků
dvojnásobek standardní odchylky a výsledná hodnota           (76,7%) negativních u obou metod, přičemž 5 vzorků
se odečetla přes kalibrační křivku stanovenou pro toto       (3,3%) bylo pozitivních pouze u metody IFA a 4
měření.                                                      vzorky (2,7%) byly pozitivní pouze u metody ELISA
                                                             (3).
Funkční senzitivita: 900 BTU. Bylo stanoveno 20
dvojic protilátek proti MAG s nízkým titrem. Pro
hodnoty absorbancí se vypočítala střední hodnota,                                  DEUTSCH
standardní odchylka (SD) a variační koeficient (CV).                                               ANWENDUNGSZWECK
Zjistili jsme, že CV menší než 10% je u titru 900            Der BÜHLMANN anti-MAG ELISA wird gebraucht
BTU.                                                         für die direkte und quantitative in vitro diagnostische
Specificita: Pro zjištění specificity soupravy anti-         Bestimmung von IgM-Autoantikörpern gegen das
MAG ELISA firmy BÜHLMANN byly provedeny                      Myelin-assoziierte Glykoprotein (MAG)(1,2).
čtyři testy:
1. NEUTRALIZACE AUTOPROTILÁTEK PROTI MAG: U                                                   PRINZIP DER METHODE
pěti vzorků séra s vysokým titrem MAG byla,                  Der vorliegende anti-MAG Autoantikörper ELISA Test ist
v závislosti na koncentraci, inhibována vazba na             ein immunometrischer Festphasen-Enzymimmunoassay.
                                                             Die Mikrotiter-Platte ist mit HOCHGEREINIGTEM HUMANEM
mikrotitrační destičku po jednohodinové inkubaci             MAG Antigen beschichtet mit höchster Spezifität und
v inkubačním pufru s přídavkem 1 až 200µg/ml MAG             Sensitivität. Standards, Kontrolle und Patientenproben
před testováním metodou ELISA.                               werden in die Antigen beschichtete Mikrotiter-Platte
2. SPECIFICITA VAZBY AUTOPROTILÁTKY PROTI MAG:               pipettiert. In der Probe vorhandene Autoantikörper binden
Pět vzorků séra se středním až vysokým titrem                während der ersten 2-stündigen Inkubation (2-8°C) an das
                                                             in der Mikrotiter-Platte immobilisierte MAG. Nicht
autoprotilátky proti MAG a pět negativních vzorků            gebundene Serumkomponenten werden durch einen
séra bylo testováno metodou GanglioCombi (EK-                Waschschritt entfernt. Anschliessend wird ein, gegen die
GCO) na destičce potažené asialo-GM1, GM1, GM2,              nachzuweisenden Autoantikörper gerichtetes, Anti-human-
GD1a, GD1b a GQ1b. Žádný ze vzorků nevykázal                 IgM-Meerrettichperoxidase (anti-IgM-HRP) Konjugat in die
poměr vyšší než 10% (poměr cut-off >12%). Podobně            Mikroküvetten der Mikrotiter-Platten pipettiert. An die
                                                             immobilisierten Antigene gebundene Autoantikörper
bylo testováno šest vzorků séra s vysokým titrem             werden während der folgenden 2-stündigen Inkubation (2-
protilátek proti gangliosidu (viz výše) a pět negativních    8°C) von diesem enzymmarkierten Tracer-Antikörpern
vzorků séra na destičce potažené MAG. Žádný z těchto         spezifisch erkannt und durch Ausbildung eines Sandwich-
patologických vzorků nevykázal signál vyšší než 300          Komplexes markiert. Ungebundenes Enzymkonjugat wird
BTU.                                                         durch erneutes Waschen eliminiert. Das zugegebene
                                                             Substrat, Tetramethylbenzidin (TMB) wird anschliessend
3. SROVNÁNÍ S METODOU IMUNOBLOT (WESTERN BLOT):              vom gebundenen Enzym zu einem blauen Endprodukt
127 vzorků pacientů (40 žen; 87 mužů; věk 4-90 let)          umgesetzt. Die Enzymreaktion wird nach 30 Minuten durch
s neurologickými potížemi, jejichž předpokládanou            Zugabe einer sauren Stop-Lösung (H2SO4) beendet,
příčinou byly autoprotilátky proti MAG, bylo                 welche die Färbung nach gelb umschlagen lässt. Die bei
testováno metodou ELISA resp. western blot. U obou           einer Wellenlänge von 450 nm gemessene optische Dichte
                                                             der Lösung ist der Konzentration Autoantikörper in den
metod byl použit MAG izolovaný z lidského                    Proben direkt proportional. Ein Set von human anti-MAG
centrálního nervového (CNS). Všech 12 vzorků séra            Autoantikörper Kalibratoren wird gebraucht um eine
se středním až velmi vysokým titrem IgM                      Standardkurve zu erstellen. Daraus lässt sich die
autoprotilátek proti MAG stanoveným metodou                  Antikörper Konzentration aus einer unbekannten Probe
ELISA bylo jednoznačně pozitivní i při metodě                berechnen.
imunoblot. 114 ze 115 vzorků séra vykazujících titr                GELIEFERTE REAGENZIEN UND VORBEREITUNG
                                                             Reagenz                Inhalt          Art.-Nr.   Rekonstitution
IgM autoprotilátek proti MAG pod hranicí cut-off             Mikrotiter-Platte     8 x 12 Micro-   B-MAG-MP    gebrauchsfertig

Revision date:   2006-07-27                          10/32                                           BÜHLMANN anti-MAG ELISA
beschichtet mit humanem MAG         küvetten mit
                                    Halter
                                                                                       Peroxid und Dimethylformamide. Die Stop-Lösung (B-
Abdeckfolien                        3 Stück                                            STS) enthält Schwefelsäure. Jeder dieser Reagenzien
                                                                   mit 900 ml
Wasch-Puffer Konzentrat (10x)
Konservierungsstoffe
                                    1 Flasche
                                    100 ml
                                                   B-MAG-WB        deionisiertem       reizt die Augen, die Haut und die
Inkubations-Puffer                  1 Flasche
                                                                   H2O verdünnen
                                                                                       Schleimhautmembranen. Berührung mit den Augen,
                                                   B-MAG-IB        gebrauchsfertig
Konservierungsstoffe                100 ml                                             der Haut und die Bekleidung vermeiden.
Kalibrator A-D1                                                 mit 1 ml
Humanserum;                         4 Flaschen     B-MAG-CASET Inkubations-
Konservierungstoffe                                             Puffer versetzen
Kontrolle tief und hoch2
                                                                                        ERFORDERLICHE LABORGERÄTE UND HILFSMITTEL
                                                                mit 1 ml
Humanserum                          2 Flaschen     B-MAG-CONSET Inkubations-           • Präzisionspipetten für 2 µl, 100 µl und 1 ml.
Konservierungstoffe                                             Puffer versetzen
Enzymmarker IgM                                                                        • Polystyren oder Polypropylen Einwegröhrchen zur
Anti-IgM-HRP in einem Protein-
basierten Puffer
                                    1 Flasche
                                    11 ml
                                                   B-MAG-ELM
                                                                   gebrauchsfertig
                                                                   blaue Lösung
                                                                                         Vorbereitung der Verdünnungsproben.
Konservierungstoffe                                                                    • 1000 ml Zylinder zur Verdünnung des
TMB-Substrat                        1 Flasche
in Zitrat-gepufferter H2O2 Lösung   11 ml
                                                   B-TMB           gebrauchsfertig       Waschpuffers.
Stopp-Lösung                        1 Flasche
                                                   B-STS
                                                                   gebrauchsfertig     • Microtiter-Platten-Waschgerät oder Spritzflasche für
0.25 M H2SO4                        11 ml                          korrosiv!
                                                                                         Waschpuffer.
                                                                            Table 3
1
    Nach der Rekonstitution enthalten die Kalibratoren A,                              • Microtiter-Platten-Schüttler.
    B, C und D 70000, 15000, 3000 und 1000 Bühlmann                                    • Microtiter-Platten-Photometer mit optischem Filter
    Titer Unit (BTU) anti-MAG Antikörper.                                                (450 nm)
2
    Kontrollen enthalten lot-spezifische anti-MAG Antikörper
    Mengen. Für Konzentrationsangaben siehe beigelegtes                                UNTERSUCHUNGSMATERIAL UND LAGERUNG
    Kontrolldatenblatt.                                                                Dieser Test benötigt
Zweimal 100 µl Kalibrator A in die Mikroküvetten       •       Eichkurve zeichnen oder die entsprechende
   B1 und B2 pipettieren.                                     geglättete Spline-Funktion mit einem „spline
   Zweimal 100 µl Kalibrator B in die Mikroküvetten           smoothed fitting“ Algorithmus berechnen.
   C1 und C2 pipettieren.                                 Proben und Kontrollen
   Zweimal 100 µl Kalibrator C in die Mikroküvetten       •   Absorption bei 450 nm jeder Probe und Kontrollen
   D1 und D2 pipettieren.                                   aufschreiben.
   Zweimal 100 µl Kalibrator D in die Mikroküvetten       •   Mittelwerte der Doppelbestimmungen berechnen.
   E1 und E2 pipettieren.                                 •   Konzentration der unbekannten Proben durch
4b.     Zweimal 100 µl Kontrolle TIEF in die                Interpolation aus der Eichkurve bestimmen.
   Mikroküvetten F1 und F2 pipettieren.                   HINWEIS: Falls das Microtiterplatten-Photometer
Zweimal 100 µl Kontrolle HOCH in die                      nicht fähig ist, Absorptionen grösser als 2 oder als die
   Mikroküvetten G1 und G2 pipettieren.                   Absorption des höchsten Kalibrators zu messen, sollte
4c.     Zweimal 100 µl von den Serumproben in die         eine zweite Messung bei 490 oder 492 nm (mit 600
   nächsten Mikroküvetten pipettieren.                    oder 620 nm-Referenzfilter, falls vorhanden)
5. Mikrotiter-Platte mit einer Abdeckfolie abdecken       durchgeführt werden. In diesem Fall sollte eine zweite
   und                                                    Eichkurve aus den Absorptionsmessungen aller
   2 Stunden (± 5 Minuten) bei 2-8°C inkubieren.          Kalibratoren bei 490 oder 492 nm gebildet werden. Die
6. Abdeckfolie entsorgen und die Mikroküvetten            Konzentration, der ausserhalb des Anzeigebereiches
   entleeren und viermal mit jeweils ≥300 µl kaltem       liegenden Proben, kann dann mit der neuen Eichkurve
   Waschpuffer waschen. Platte durch Ausschlagen auf      bestimmt werden. Die Messungen bei 490 oder 492
   saugfähigem Papier sorgfältig trocknen.                nm dürfen in keinem Fall die „on-scale“ Messungen
7. 100 µl Enzymmarker IgM zu jeder Mikroküvette           bei 450 nm ersetzen.
   zugeben.                                               Resultat- und Eichkurvenbeispiel
8. Mikrotiter-Platte mit einer Abdeckfolie abdecken       Siehe Table 11 sowie Figure 1. Die Tabelle zeigt
   und                                                    typische Messwerte für den anti-MAG Test. Die
   2 Stunden (± 5 Minuten) bei 2-8°C inkubieren.          Daten dienen nur der Illustration und sind nicht dazu
9. Abdeckfolie entsorgen und die Mikroküvetten            bestimmt, die Ergebnisse eines anderen
                                                          Testenansatzes danach zu berechnen. Eine Eichkurve
   entleeren und viermal mit jeweils ≥300 µl kaltem
                                                          muss für jeden Probensatz jeweils neu ermittelt
   Waschpuffer waschen. Platte durch Ausschlagen auf
                                                          werden.
   saugfähigem Papier sorgfältig trocknen.
Wichtig: TMB-Substrat auf 18-28°C erwärmen.
                                                             GRENZWERT (CUT-OFF) UND STANDARDISIERUNG
10.     100 µl TMB-Substrat zu jeder Mikroküvette         Die Frequenz der Anti-MAG Autoantikörper in normalem
   zugeben.                                               Humanserum wurde mit Blutproben von asymptomatischen
11.     Mikrotiter-Platte mit Abdeckfolie abdecken        Blutspendern (männliche und weibliche Erwachsene von
   und 30 Minuten (± 5 Minuten) bei 18-28°C auf           18 zu 70 Jahre alt) ermittelt. 150 Serumproben wurden
   einem Mikrotiter-Platten-Schüttler (800-1000 rpm)      entsprechend der Arbeitsanleitung untersucht und die in
                                                          Table 12 angegebene Ergebnisse wurden erhalten.
   inkubieren. Platte vor direktem Licht schützen.        HINWEIS: Die angegebenen Werte dienen nur als
12.     100 µl Stopp-Lösung zu jeder Mikroküvette         Richtlinie. Es wird empfohlen, dass jedes Labor eigene zu
   zugeben und allfällige Luftblässchen mit               erwartende Normalbereiche ermittelt, welche auf ihre
   Pipettenspitzen entfernen.                             Patientenpopulation zutreffen.
13.     Optische Dichte bei 450 nm innerhalb der          Vorgeschlagener Grenzwert (Cut-Off)
                                                          Der Mittelwert + 3 Standardabweichungen [SD] ergibt einen
   nächsten                                               technischen Cut-Off von 729 BTU. Aus praktischen Gründen
   30 Minuten messen. Bi-chromatische Messung mit         wird den GRENZWERT VON 1000 BTU als positive Cut-Off-
   einer Referenzfilterwellenlänge im Bereich von         Konzentration empfohlen, der zum untersten Standard der
   600-620 nm ist empfehlenswert.                         Eichkurve (Kalibrator D) korrespondiert.
                                                          Standardisierung
                                         RESULTATE        Mangels einer internationalen Referenzpräparation
Eichkurve                                                 wurde der Assay gegen interne Referenzen (zehn
•   Absorption bei 450 nm von jedem Kalibrator            individuelle Humanseren mit niedrigem, mittlerem
  aufschreiben.                                           und hohem Anti-MAG Autoantikörper-Titer)
•   Mittelwerte der Doppelbestimmung der                  kalibriert. Die Spezifizität und der
  gemessenen Kalibrator-Absorptionen berechnen.           Autoantikörpergehalt dieser Proben, wurde zuvor
•   Auf halblogarithmischem Papier, die Absorptions-      mittels eines Anti-MAG Immunoblots charakterisiert.
  Mittelwerte der Kalibratoren (Y-Achse/linear) gegen     Die Definition der Bühlmann Titer Units (BTU)
  die in BTU (siehe unten) gegebenen Konzentrationen      lautet wie folgt:
  (X-Achse/ logarithmisch) auftragen.

Revision date:   2006-07-27                       12/32                                     BÜHLMANN anti-MAG ELISA
•     Der Antikörpergehalt in Proben normaler                 mit Inkubations-Puffer 1:1000 bis 1:64000 verdünnt,
    Blutspender wurde im Anti-MAG Test entsprechend           für eine Stunde bei 18-28°C stehen gelassen und
    der Arbeitsanleitung bestimmt.                            danach entsprechend der Arbeitsanleitung getestet
•     Lineare Verdünnungsreihen der Proben des internen       (siehe Table 15). Es wird vermutet, dass die relativ
    Referenzpools wurden in demselben Testansatz              hohen Abweichungen, in ungefähr 50% der Proben,
    mitbestimmt.                                              aufgrund von Antikörper Aggregaten zustande
•   Die Verdünnung, bei der die jeweilige                     kommt. Im Allgemeinen enthalten aber pathologische
 Referenzprobe unter den zuvor auf der Basis der              Seren sehr hohe Autoantikörper Titer, sodass dies
 Normalproben errechneten Cut-Off fällt, entspricht           keinen Einfluss auf die positiv/negativ Diskrimination
 dann dem Titer der Referenzprobe in Bühlmann Titer           hat.
 Units.
                                                              Analytische Sensitivität: 444 BTU. 20
HINWEIS: Die für die Anti-MAG ermittelten
                                                              Doppelansätze mit Inkubations-Puffer wurden gleich-
Serumtiter sind abhängig von der verwendeten
                                                              zeitig angesetzt. Mittelwert und Standardabweichung
Methode und daher nicht direkt untereinander
                                                              wurden für die Absorbtionswerte berechnet. Die
vergleichbar. Für longitudinale Studien können nur
                                                              kleinste nachweisbare Menge für anti-MAG
solche Ergebnisse miteinander verglichen werden, die
                                                              Autoantikörper wurde durch Addition von zwei
mit derselben Methode ermittelt wurden.
                                                              Standardabweichungen zum Mittelwert der
                                                              Absorption berechnet. Die Intersektion dieses Wertes
                                 QUALITÄTSKONTROLLE
Ein vollständiges Verständnis dieser                          mit der Standardkurve ergab einen Wert von 444
Testpackungsbeilage ist für den erfolgreichen                 BTU.
Gebrauch des Produktes notwendig. Zuverlässige                Funktionelle Sensitivät: 900 BTU. 20 Doppelansätze
Resultate werden nur erreicht, durch die Anwendung            von Proben mit tiefen anti-MAG Autoantikörpern
„Guter Laborpraxis“ (aktuelle GLP Richtlinien) und            wurden gleichzeitig angesetzt. Mittelwert,
die Einhaltung der Arbeitsanleitung.                          Standardabweichung (SD) und Variationskoeffizient
Da es keine kommerziell erhältliche Anti-MAG                  (CV) wurde von den Absorptionswerten berechnet.
Autoantikörper Kontrolle gibt, wird empfohlen,                Einen CV von 10% wurde bei einem Titer von 900
positive Serumproben als interne Qualitätskontrolle           BTU erreicht.
anzuwenden.                                                   Spezifizität: Vier Versuchsansätze wurden
Alle Kontrollen müssen im etablierten                         durchgeführt, um die Spezifizität des BÜHLMANN
Vertrauensbereich liegen. Die Vertrauensbereiche der          anti-MAG ELISA Testes zu ermitteln:
Kontrollen sind Lot-spezifisch und sind auf dem               1. NEUTRALISIERUNG DER ANTI-MAG-
zusätzlichen Kontrollblatt angegeben.                         AUTOANTIKÖRPER: Die Bindung zwischen der mit
Die Reproduzierbarkeit der Eichkurvenparameter und            MAG beschichteten Microtiter-Platte und 5 Seren mit
der Kontrollwerte sollte innerhalb des etablierten            hohen anti-MAG Antikörper-Spiegel, wurde durch eine
Erwartungs-bereiches liegen. Falls die Präzision des          einstündige Vorinkubation mit 1 to 200 µg/ml MAG
Testes nicht mit dem etablierten Erwartungsbereich            und Inkubations-Puffer vor dem eigentlichen Test mit
übereinstimmt und wiederholte Messungen ein                   der ELISA Methode, konzentrationsabhängig
technisches Problem ausschliessen, sind folgende              gehemmt.
Bedingungen zu überprüfen: i) Pipettierung,                   2. SPEZIFITÄT DER ANTI-MAG AUTOANTIKÖRPER
Temperatur- und Zeitmessende Geräte, ii) Photometer           BINDUNG: Fünf Seren mit mittleren bis hohen anti-
Eichung, iii) Verfallsdaten der Reagenzien, iv)               MAG Autoantikörper Titern sowie fünf negative
Lagerung- und Inkubations-Bedingungen, v) die TMB             Seren wurden auf einer GanglioCombi (EK-GCO)
Substratlösung sollte farblos sein, vi) Wasserreinheit.       Microtiter-Platte getestet welche mit den folgenden
                                                              Gangliosiden beschichtet sind: asialo-GM1, GM1,
                                  LEISTUNGSMERKMALE           GM2, GD1a, GD1b und GQ1b. Keine der Proben
Intra-Assay Präzision (Within-Run): 6.5%. Die                 zeigte ein Verhältnis (Ratio) welches grösser als 10%
intra-assay Präzision wurde bestimmt durch die 20-            war (Cut-Off Ratio >12%). Auf ähnliche Weise
fache Doppelmessung im gleichen Ansatz (siehe Table           wurden sechs Seren mit hohen anti-Ganglioside
13).                                                          Autoantikörper Titer (siehe oben), sowie fünf negative
Inter-Assay Präzision (Run-to-Run): 15.4%. Die                Seren auf MAG beschichteten Microtiter-Platten
inter-assay Präzision wurde bestimmt durch die 20-            getestet. Keines dieser pathologischen Seren ergab ein
fache Doppelmessung in 20 verschiedenen Ansätzen              Signal, das höher als 300 BTU war.
(siehe Table 14).                                             3. VERGLEICH MIT DER IMMUNOBLOT METHODE
Verdünnungslinearität: 147%. Sieben Serumproben               (WESTERN BLOT): 127 Seren von Patienten (40
mit erhöhten anti-MAG Autoantikörper Titer wurden             weibliche, 87 männliche, Alter 4-90 Jahren) mit
                                                              vermutlich anti-MAG verursachten neurologischen
Revision date:   2006-07-27                           13/32                                   BÜHLMANN anti-MAG ELISA
Krankheiten wurden mit dem ELISA Test und einer                                          FRANCAIS
Immunoblot-Methode untersucht. In beiden Methoden                                                    DOMAINE D’UTILISATION
wurde aus humanem Zentral-Nervensystem isoliertes        La trousse BÜHLMANN anti-MAG ELISA a été
MAG eingesetzt. Alle 12 Seren, die mit der ELISA         conçue pour la détermination diagnostique
Methode mittelhohe bis sehr hohe anti-MAG-               quantitative in vitro des auto-anticorps IgM humains
Autoantikörper Werte zeigten, waren auch mit der         dirigés contre la glycoprotéine associée à la myéline
Immunoblot Methode deutlich positiv. Von den 115         (MAG) (1,2).
Proben, die einen anti-MAG-Autoantikörper-Spiegel
unter dem Grenzwert (Cut-Off) der ELISA Methode                                                             PRINCIPE DU DOSAGE
hatten, sind auch 114 mit Immunoblot negativ getestet    Le test de dosage des autoanticorps anti-MAG ELISA
worden. Ein Serum war leicht positiv mit der             repose sur la technique d’amplification enzymatique
Immunoblot Methode (F. Ferracin and A.J. Steck,          quantitative de type “sandwich”. Une microplaque
pers. Kommunkation).                                     précoatée de MAG de cerveau humain hautement
4. VERGLEICH MIT DER IFA (INDIRECT                       purifiée est utilisée. Les calibrateurs et les échantillons
IMMUNOFLUORESCENCE ASSAY) METHODE: Es wurden             sériques sont incubés pendant 2 heures dans les puits
150 Serumproben von Patienten (Geschlecht und            de microplaque. Au cours de cette incubation, les
Alter unbekannt) mit diagnostizierter IgM                auto-anticorps anti-MAG sont liés par la MAG
monoklonaler Gammopathie mit Hilfe der ELISA-            humaine coatée. Après lavage des molécules non-
und einer IFA-Methode getestet. In der IFA Methode       liées, un anticorps dirigé contre les IgM humaines
wurden Seren mit gefrorenen und Azeton-fixierten         marqué avec la peroxydase de raifort (anti-IgM-HRP)
Querschnitten von Affen Ischiasnerven inkubiert.         est ajouté dans les puits. La microplaque est incubée
Gebundene anti-MAG Antikörper wurden dann                pendant 2 heures supplémentaires. Après élimination
mittels anti-human-IgM Autoantikörper ermittelt. 26      par lavage des anticorps marqués non-liés, la solution
Proben (17.3%) waren mit beiden Methoden positiv         contenant le substrat tétraméthylbenzidine (TMB) est
getestet. 115 Patienten (76.7%) waren mit beiden         ajoutée dans les puits. La microplaque est incubée
Methoden negativ. 5 Proben (3.3%) sind nur mit der       pendant 30 minutes. Une coloration bleue se
IFA Methode und 4 Proben (2.7%) nur mit der ELISA        développe proportionnellement à la quantité d’auto-
Methode positiv getestet worden (3).                     anticorps anti-MAG liés lors de l’étape initiale. La
                                                         réaction de coloration est stoppée par l’addition d’une
                                                         solution stop acide (H2SO4) faisant passer la couleur
                                                         du bleu au jaune. L’intensité de la coloration est
                                                         déterminée par mesure de l’absorbance à 450 nm dans
                                                         un lecteur de microplaques. L’absorbance mesurée est
                                                         directement proportionnelle à la concentration d’auto-
                                                         anticorps anti-MAG présente dans chaque échantillon.
                                                         Les concentrations inconnues d’auto-anticorps anti-
                                                         MAG humaine des échantillons sont déterminées à
                                                         l’aide d’une courbe d’étalonnage obtenue au moyen
                                                         des calibrateurs livrés dans la trousse.

                                                                                REACTIFS FOURNIS ET PREPARATION
                                                         Réactifs                   Quantité       Code             Reconstitution
                                                                                    12 barrettes
                                                         Microplaque
                                                                                    de 8 puits +   B-MAG-MP         Prête à l’emploi
                                                         96 puits, précoatée-MAG
                                                                                    support
                                                         Film adhésif               3
                                                         Tampon de lavage concentré
                                                                                    1 flacon                        A reconstituer avec 900
                                                         (10x)                                     B-MAG-WB
                                                                                    100 ml                          ml d’eau déionisée
                                                         avec conservateurs
                                                         Tampon d’incubation        1 flacon
                                                                                                   B-MAG-IB         Prêt à l’emploi
                                                         avec conservateurs         100 ml
                                                                             1
                                                         Calibrateurs A à D                                         A reconstituer avec 1
                                                         sérum humain avec          4 flacons      B-MAG-CASET      ml de tampon
                                                         conservateurs                                              d’incubation
                                                                               2
                                                         Contrôles élevé et bas                                     A reconstituer avec 1
                                                         sérum humain avec          2 flacons      B-MAG-CONSET     ml de tampon
                                                         conservateurs                                              d’incubation
                                                         Marqueur Enzymatique
                                                         IgM                        1 flacon                        Prêt à l’emploi
                                                                                                   B-MAG-ELM
                                                         anti-IgM-HRP avec          11 ml                           Solution bleue
                                                         conservateurs
                                                         Substrat TMB
                                                                                    1 flacon
                                                         TMB en tampon citrate +                   B-TMB            Prêt à l’emploi
                                                                                    11 ml
                                                         H2O2
                                                         Solution Stop              1 flacon                        Prêt à l’emploi
                                                                                                   B- STS
                                                         0.25 M H2SO4               11 ml                           Corrosif

Revision date:   2006-07-27                      14/32                                                       BÜHLMANN anti-MAG ELISA
You can also read