Quantum Blue fCAL extended

 
Quantum Blue®
                                fCAL extended
                                          Quantitative
                                   Lateral Flow Assay

                                        For In Vitro Diagnostic Use.

                                    LF-CALE25           25 tests

                                          Release date: 2019-12-20
                                                        Version A1

BÜHLMANN Laboratories AG
                                              English   page      3
                                              Deutsch Seite       8
Baselstrasse 55
4124 Schönenbuch, Switzerland                 Français page      14
Tel.: +41 61 487 1212                         Italiano  pagina   20
Fax: +41 61 487 1234                          Español página     26
info@buhlmannlabs.ch                          Português página   32
Release date: 2019-12-20   2/42   Quantum Blue® fCAL extended
ENGLISH                                          REAGENTS & MATERIAL SUPPLIED
                                                                               SUPPLEMENTARY
INTENDED USE                                                                   Fecal extraction devices
The BÜHLMANN Quantum                  Blue®
                                     fCAL extended is an in                    Fecal extraction devices described below are not delivered
vitro diagnostic test for the quantitative determination of                    with the kit and either of them has to be ordered with the
calprotectin in human stool specimens intended as an aid                       kit.
in the assessment of intestinal mucosal inflammation. The                       Extraction device
                                                                                                    Quantity                         Code
assay results can be used as an aid to diagnosis in                             Kits
distinguishing organic, inflammatory disease of the                                                 Packages of 50, 200 or 500       B-CALEX-C50
gastrointestinal tract (inflammatory bowel disease, IBD,                        CALEX® Cap          tubes available, filled with
                                                                                                                                     B-CALEX-C200
                                                                                device              5 mL extraction buffer
specifically Crohn’s disease or ulcerative colitis, UC) from                                                                         B-CALEX-C500
                                                                                                    Ready to use
functional disease (irritable bowel syndrome, IBS) (ref. 1-7),
in patients with chronic abdominal pain and as an aid to                                            50 tubes consisting of
                                                                                Smart-Prep                                           B-CAL-RD
IBD disease monitoring (ref. 7-18).                                                                 spatulas and base caps
For laboratory use only.                                                                            50 tubes consisting of tube,
EU: For professional use.                                                       ScheBo® Quick-      cone & dosing tip, each filled
                                                                                                    with 1.3 mL extraction buffer    B-CAL-SO50
                                                                                PrepTM
                                                                                                    Ready to use
PRINCIPLE OF THE ASSAY
                                                                                                                                                Table 2
The test is designed for the selective measurement of
calprotectin antigen by sandwich immunoassay. A                                MATERIALS REQUIRED BUT NOT PROVIDED
monoclonal capture antibody (mAb) highly specific for
calprotectin is coated onto the test membrane. A second                        • Vortex mixer for stool extraction
monoclonal detection antibody conjugated to gold colloids                      • Precision pipettes with disposable tips: 10-100 µL, 100-
is deposited onto the conjugate release pad and released                         1000 µL and 250-2500 µL
into the reaction system after addition of the extracted and
diluted stool sample. The calprotectin / anti-calprotectin                     • Centrifuge
gold conjugate binds to the anti-calprotectin antibody                         • 5 mL polypropylene or polystyrene tubes for dilution of
coated on the test membrane (test line) and the remaining                        the extracts
free anti-calprotectin gold conjugate binds to the goat anti-                  • Timer (optional)
mouse antibody coated on the test membrane (control
                                                                               • Quantum Blue® Reader available from BÜHLMANN
line). The signal intensities of the test line (T) and the
                                                                                 (order code: BI-POCTR-ABS)
control line (C) are measured quantitatively by the
BÜHLMANN Quantum Blue® Reader.                                                 • Soft tissues or blotting paper

REAGENTS SUPPLIED AND PREPARATION                                              PRECAUTIONS
Reagents                   Quantity    Code               Comments             Safety precautions
                                                          vacuum-              • The controls of this test contain components of human
Test Cassette              25 pieces   B-LFCALUS-TC       sealed in a            origin. Although tested and found negative for HBV
                                                          foil pouch             surface antigen, HCV and HIV1/2 antibodies, the
                           1 bottle                                              reagents should be handled as if capable of transmitting
Extraction Buffer                      B-CAL-EX           Ready to use
                           125 mL                                                infections and should be handled in accordance with
                           2 vials                                               Good Laboratory Practices (GLP) using appropriate
Controls Low* / High*                  B-CALE-CONSET Ready to use
                           0.5 mL                                                precautions.
RFID Chip Card             1 piece     B-CALE-RCC
                                                          White plastic        • Patient specimens should be handled as if capable of
                                                          card                   transmitting infections and should be handled in
RFID Chip Card             1 piece     B-CALE-RCC720
                                                          Green plastic          accordance with Good Laboratory Practice (GLP) using
                                                          card                   appropriate precautions.
                                                                   Table 1
* The controls contain lot specific amounts of native human calprotectin.
                                                                               • Reagents: Avoid contact of reagents with the skin, eyes,
  Refer to the additional QC data sheet for actual concentrations.               or mucous membranes. If contact does occur,
                                                                                 immediately wash with generous amounts of water;
STORAGE AND SHELF LIFE OF REAGENTS                                               otherwise, irritation can occur.
                                                                               • Reagents and chemicals have to be treated as
All kit components are stable at 2-8 °C until the expiration
                                                                                 hazardous waste according to the national biohazard
date printed on the labels.
                                                                                 safety guideline or regulation.

Release date: 2019-12-20                                                3/42                                          Quantum Blue® fCAL extended
Technical precautions                                           measurement of the extracts see step 2 under the chapter
                                                                assay procedure.
Kit components                                                  Fecal calprotectin extracts obtained by manual weighing
• All reagents and test samples must be equilibrated to         method, by BÜHLMANN Smart-Prep or by ScheBo® Quick-
   room temperature (18-28 °C) before starting the assay.       Prep™ are stable at 2-8 °C for ≤ 7 days or at -20 °C for
• Mix well (vortex) the reagents before use.                    36 months.
• Components must not be used after the expiry date
  printed on the labels.                                        ASSAY PROCEDURE
• Do not mix different lots of reagents.                        The assay procedure consists of three steps:
• Test cassettes cannot be re-used.                             1. Extraction of stool samples
Test procedure                                                     The extraction is described in the instruction for use
                                                                   delivered with the respective extraction devices.
• Read the instructions carefully prior to carrying out the
  assay. Assay performance will be adversely affected, if          CALEX® Cap device: Liquid stool samples can be
  reagents are incorrectly diluted, handled or stored under        pipetted directly into the CALEX® Cap device. Unscrew
  conditions other than those as detailed in this instruction      the blue cap and pipet 10 μL of stool sample into the
  for use.                                                         device. Recap the CALEX® Cap device and proceed
                                                                   with vortexing step according to the extraction
• The Quantum Blue® Reader must be switched on and
                                                                   procedure described and illustrated in the instruction for
  programmed for the Quantum Blue® fCAL extended
                                                                   use delivered with the CALEX® Cap device.
  assay. Load the assay method using the RFID chip card
  (B-CALE-RCC or B-CALE-RCC720) before starting the             2. Sample processing
  assay (see Quantum Blue® Reader manual).                      • Smart-Prep or ScheBo® Quick PrepTM: Let the stool
• Use the RFID chip card in order to change lot-specific           extract settle for 10 minutes after extraction. Dilute the
  test parameters.                                                 supernatant 1:10 with extraction buffer (e.g. 50 µL stool
                                                                   extract and 450 µL extraction buffer) and mix well. Let
• Patient samples that are not properly handled may
                                                                   the samples equilibrate for at least 5 minutes at 18-
  cause inaccurate results.
                                                                   28 °C prior to proceeding to the next step (step no. 3).
• In order to receive reliable and quantitative results it is
                                                                • CALEX® Cap device: After extraction, let the stool
  important to homogenize the stool sample entirely in the
                                                                  extract settle for 10 minutes with the white head of the
  extraction device.
                                                                  device down. Unscrew the blue cap. The supernatant
• With BÜHLMANN Smart-Prep and ScheBo® Quick-                     can be used without further dilution in the lateral flow
  PrepTM, it is important to centrifuge the extracts before       assay.
  storage. Centrifuge the tubes for 5 minutes at 3000 x g.
  After centrifugation the supernatant must be transferred      3. Lateral flow assay procedure and readout
  into a fresh storage tube.                                    Two alternative methods can be loaded from the respective
                                                                RFID chip card: B-CALE-RCC or B-CALE-RCC720. Select
SPECIMEN COLLECTION AND STORAGE                                 one of the RFID chip cards before starting the experiments.
                                                                Load the test method from the RFID chip card on the
For the extraction procedure, less than 1 g of native stool     Quantum Blue® Reader.
specimen is required. Collect stool specimen into plain
tubes.
Important: The specimen must be collected without any
chemical or biological additives.
Specimen transport
Stool specimens should be received for processing by the
laboratory within 3 days of collection. The specimens may
be transported at room temperature or refrigerated.
Specimen storage
Stool specimens should be refrigerated at 2-8 °C and
extracted within 3 days of receipt at the laboratory. Do not
store samples at elevated temperatures.
                                                                3.1. Method  with internal timer
Extract storage                                                 • Use the green RFID chip card.
Fecal calprotectin extracts obtained with CALEX® Cap            • Load the test cassette onto the test cassette holder of
device are stable at room temperature for 3 days and at           the reader.
2-8 °C for up to 6 days. For longer storage, freeze extracts
at -20 °C. Frozen extracts are stable for a period of up to     • Add 60 µL of diluted stool extract onto the sample
23 months.                                                        loading port of the test cassette.
CALEX® Cap extracts can be stored and frozen directly           • Close the test cassette holder and              start   the
within the CALEX® Cap device. Extracts can be subject to          measurement by pressing the start button.
four freeze-thaw cycles. Prior to measurement, allow frozen     • The scan starts automatically after 12 minutes (720
extracts to equilibrate to room temperature. For re-use / re-     seconds).
Release date: 2019-12-20                                 4/42                                    Quantum Blue® fCAL extended
• For low / high controls: Repeat step 3.1 with 60 µL                   is detectable after 12 minutes of incubation time (figure
  controls instead of diluted stool extract.                            1B), the calprotectin concentration present in the stool
                                                                        sample is calculated by the Quantum Blue® Reader.
                                                                     • If only the test line (T) is detectable after 12 minutes of
                                                                       incubation time (figure 1C), the test result is invalid and
                                                                       the assay has to be repeated using another test
                                                                       cassette.
                                                                     • If neither the control line (C) nor the test line (T) are
                                                                       detectable after 12 minutes of incubation time (figure
                                                                       1D), the test result is invalid and the assay has to be
                                                                       repeated using another test cassette.
                                                                     • As the Quantum Blue® Reader allows a quantitative
                                                                       evaluation of the test (T) and control (C) lines, an
                                                                       additional validity check of the control line (C) is
3.2. Method  without internal timer                        undertaken. If the signal intensity of the control line (C)
• Use the white RFID chip card.                                        is below a threshold after 12 minutes of incubation time,
• Add 60 µL of diluted stool extract onto the sample                   the test result is also invalid and the assay has to be
  loading port of the test cassette.                                   repeated using another test cassette.
• Incubate for 12 minutes +/- 1 minute (set a timer
  manually).
                                                                     STANDARDIZATION
• Load the test cassette onto the test cassette holder of            • The Quantum Blue® fCAL extended is standardized with
  the reader.                                                          the BÜHLMANN fCAL® ELISA (order code: EK-CAL).
• Scan the test cassette with the Quantum Blue® Reader               • The Quantum Blue® Reader uses a lot-specific standard
  by pressing the start button immediately.                            curve to calculate the calprotectin concentration. The
                                                                       assay range is between 30 and 1000 µg/g.
• For low / high controls: Repeat step 3.2 with 60 µL of
  controls instead of diluted stool extract.                         • To receive quantitative results for calprotectin
                                                                       concentration between 850-1800 µg/g, high samples
                                                                       reading above 850 µg/g can be re-tested with the
                                                                       BÜHLMANN Quantum Blue® high range test (order
                                                                       code: LF-CHR25).

                                                                     LIMITATIONS
                                                                     • Reagents delivered with the BÜHLMANN Quantum
                                                                       Blue® fCAL extended kit are intended for the
                                                                       determination of calprotectin levels in human stool
                                                                       samples only.
Remark: Please refer to the Quantum Blue® Reader                     • Fecal calprotectin values are intended as an aid to
manual to learn more about the basic functions and how to              diagnosis in distinguishing organic disease from
initialize and operate the reader, especially how to select            functional disease and as an aid to IBD monitoring.
test methods, and how to load lot specific parameters from             Results should always be interpreted in combination
the RFID chip card on the Quantum Blue® Reader.                        with other clinical and laboratory findings.
                                                                     • For IBD disease monitoring, multiple fecal calprotectin
QUALITY CONTROL                                                        measurements performed at up to 4 weeks intervals
                                                                       have been suggested to have best diagnostic accuracy
• If the performance of the assay does not correlate with              in predicting clinical relapse in patients (ref. 19-20).
  the established limits and repetition excludes errors in
                                                                     • In rare cases, when calprotectin levels are extremely
  technique, check the following issues: i) pipetting,
                                                                       high (above 4000 μg/g, ie. in acute UC), the test system
  temperature controlling and timing ii) expiration dates of
                                                                       may be prone to a high dose hook effect, that can result
  reagents and iii) storage and incubation conditions.
                                                                       in values below the expected 850 μg/g upper limit of the
• The result of the self-test of the Quantum Blue® Reader              linear range. It is advised to give particular attention to
  performed at startup has to be valid.                                results above 300 μg/g when accompanied by strong
                                                                       symptoms, which could indicate acute inflammation. In
VALIDATION OF RESULTS                                                  this case retesting of a patient’s stool sample by a
                                                                       laboratory in timely manner is recommended for
• For a valid test result, the control line (C) must be visible
                                                                       confirmation.
  in any case (see figures 1A and 1B). It is used as
  functional test control only and cannot be used for the            • Patients who are taking NSAIDs regularly may have
  interpretation of the test line (T). If the test line (T) is not     elevated fecal calprotectin levels.
  detectable after 12 minutes of incubation time (figure             • Results may not be clinically applicable to children less
  1A), the concentration of calprotectin present in the                than 4 years of age who have mildly increased fecal
  stool sample is below the detection limit. If a test line (T)        calprotectin levels (ref. 21-24).
Release date: 2019-12-20                                     5/42                                     Quantum Blue® fCAL extended
INTERPRETATION OF RESULTS                                           A clinical sensitivity of 93.3% at 80 µg/g and a clinical
                                                                    specificity of 83.7% at 160 µg/g, can be reached in the
I. Distinguishing organic disease from functional                   differentiation between IBD and GI-related non-
gastrointestinal disease                                            inflammatory conditions, including IBS. ROC curve analysis
The determination of fecal calprotectin levels can be used          resulted in an AUC of 0.923 (refer to table 5).
as a reliable and simple aid in distinguishing organic from         A clinical sensitivity of 93.3% at 80 µg/g and a clinical
functional gastrointestinal diseases (ref. 1-7).                    specificity of 85.4% at 160 µg/g, can be reached in the
The result categories are based on data from clinical               differentiation between IBD and IBS. ROC curve analysis
studies performed by BÜHLMANN and are BÜHLMANN’s                    resulted in an AUC of 0.933 (refer to table 6).
recommendations. All test results should be interpreted in          The optimal cut-off combination for these patient pools
conjunction with information available from the patient’s           could be defined by ROC analysis at 80 µg/g and 160 µg/g
clinical symptoms, medical history, and other clinical and          calprotectin, which is slightly more stringent than a
laboratory findings.                                                combination of a more sensitive lower cut-off of 50 µg/g
Clinical thresholds                                                 with lower performance in specificity, and an upper cut-off
                                                                    of 200 µg/g with slightly lower sensitivity (table 7 and 8).
The following data were established with the BÜHLMANN
fCAL® ELISA (order code: EK-CAL).                                   II. IBD monitoring
Results from 58 clinical samples from patients diagnosed            Clinical thresholds and evaluation
with IBS and 131 clinical samples from patients diagnosed           The determination of fecal calprotectin is also a reliable and
with IBD, from an international clinical study, were analyzed       simple way to assist the monitoring of IBD patients
to obtain the values described in table 3.                          (ref. 7-18).
Calprotectin                                                        Correlation of calprotectin levels and the inflammatory
                   Interpretation         Follow-up
concentration                                                       status of patients’ intestinal mucosa, according to
< 80 µg/g          Normal                 None                      endoscopic evaluations, was determined in three
                                                                    independent studies using BÜHLMANN calprotectin tests
                                          Follow-up within 4 – 6
80 - 160 µg/g      Gray-zone/Borderline                             (table 9). The diagnostic value of calprotectin in predicting
                                          weeks
                                                                    clinical remission and relapse, according to patient`s
> 160 µg/g         Elevated               Repeat as needed
                                                                    symptoms, clinical activity indices, unplanned need for
                                                         Table 3    therapy escalation, hospitalization or emergency was
Calprotectin values below 80 μg/g                                   determined in three studies using BÜHLMANN calprotectin
Fecal calprotectin values 160 µg/g are indicative of               indicate the necessity of tighter control in the following
neutrophil infiltrate in the gastrointestinal tract; therefore,     period to assess disease development tendencies.
this may signal the presence of active inflammatory                 Calprotectin values above 300 µg/g:
disease. Appropriate further investigative procedures by            Fecal calprotectin levels above 300 µg/g should be
specialists are suggested to achieve an overall clinical            repeated and, if raised levels are confirmed, prompt further
diagnosis.                                                          investigative procedures (ref. 7-18).
Clinical evaluation
The ability of the BÜHLMANN fCAL® ELISA to discriminate
between patients with IBD and other non-inflammatory GI
disorders, including IBS, was tested in a clinical study with
a total of 337 adult and pediatric patients. One hundred and
thirty five (135) patients had a final diagnosis of IBD
(Crohn’s disease, ulcerative colitis or indeterminate colitis),
130 patients suffered from IBS and 72 patients presented
with abdominal pain and/or diarrhea, or other GI-related
non-inflammatory conditions (refer to table 4). Final
diagnosis was supported by endoscopic as well as other
clinical findings.
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PERFORMANCE CHARACTERISTICS                                     Limit of Quantification (LoQ):
                                                                Lower LoQ: ≤30 (28.2) µg/g calprotectin.
Method comparison
                                                                Upper LoQ: ≥1000 (1002) µg/g calprotectin.
Bias at clinical decision points:
                                                                The LoQ was established according to CLSI guideline
50 μg/g: 10.6% (95% CI: -2.1-36%)
                                                                EP17-A. To determine the lower LoQ, four extracted stool
200 μg/g: -2.2% (95% CI: -4.9-4.7%)                             samples with calprotectin concentrations ranging from 19.1
100 μg/g: 2.1% (95% CI: -2.7-14%)                               to 37.3 µg/g were measured in ten replicates to produce 40
300 μg/g: -3.6% (95% CI: -7.0-2.3%)                             values (table 14). To determine the upper LoQ, four
                                                                extracted stool samples with calprotectin concentrations
The method comparison study was performed according to
                                                                ranging from 628 to 1001.7 µg/g were measured in ten
the CLSI guideline EP09-A3. One hundred and eighty six
                                                                replicates to produce 40 values (table 15). The study was
(186) extracted clinical stool samples were measured
                                                                performed with two different test cassette lots. Reference
according to the instruction for use with the Quantum Blue®
                                                                calprotectin values of extracted stool samples were
fCAL extended test and with the BÜHMANN fCAL® ELISA.
                                                                determined with the BÜHLMANN fCAL® ELISA. The
Measurements were performed over three days using three
Quantum Blue® fCAL extended test cassette lots (figure 2).      relative total error was calculated using the RMS model
                                                                from estimates of precision and bias to the reference
Recovery: 102%-121%                                             values, for each sample. The LoQ was defined as the
Six stool specimen extracts were spiked with 150 μg/g           lowest and highest sample concentration, for the lower LoQ
calprotectin in calibrator material of human serum origin.      and upper LoQ, respectively, which met the acceptance
The baseline extract was spiked with the corresponding          criterion of 30% relative total error.
amount of extraction buffer. Baseline and spiked samples        Linearity: 30-850 μg/g
were measured in eight replicates. One test cassette lot
was used. The results are summarized in table 11.               The linear range of the Quantum Blue® fCAL extended
                                                                assay was determined according to CLSI guideline EP06-
Repeatability: 15.3-19.1% CV                                    A. Two extracted stool samples with low and high
Within-laboratory precision: 18.0-23.0% CV                      calprotectin concentrations were blended to obtain a total
Repeatability and within-laboratory precision were              of 14 concentration levels covering and exceeding the
determined according to CLSI guideline EP05-A2. Four            expected measuring range. The blends were assayed in
extracted stool samples, including extracts with calprotectin   ten replicates on two test cassette lots. Mean calprotectin
levels close to clinical decision points, were measured over    concentration values of each blend were plotted against the
ten days, in two independent runs each day, with two            dilution factor used to obtain the blend. Linear as well as
replicates per run. A single reagent lot was used (table 12).   second and third order polynomial fitting was applied.
                                                                Where coefficients of the second and third order polynomial
Inter-lot precision: 16.5-20.6% CV                              fits were determined to be significant, the linear range was
Inter-lot precision was determined according to CLSI            defined as the interval of calprotectin concentration in
guideline EP05-A2. Four extracted stool samples, including      which deviation from the linear fit did not exceed 20%
extracts with calprotectin levels close to clinical decision    relative concentration value or 20 μg/g (figure 3).
points, were measured using three different reagent lots.
                                                                High dose hook effect
The measurements were performed over five days, in a
single run each day, with two replicates per run (table 13).    No high dose hook effect was observed for calprotectin
                                                                concentrations up to 1500 µg/g. Decrease in mean signal
Limit of Blank (LoB): 6.7 µg/g calprotectin.                    below the 850 μg/g upper linear range limit was estimated
The LoB was established according to CLSI guideline             for calprotectin concentrations above 4000 μg/g. No value
EP17-A using extraction buffer to obtain 60 blank values.       below the highest clinical decision point of 300 µg/g was
The study was performed with two different test cassette        observed for any of the single replicate results for all high
lots.                                                           samples tested. Seven to eight extracted stool samples
                                                                with calprotectin concentrations ranging from 1361 µg/g to
Limit of Detection (LoD): 18 µg/g calprotectin.
                                                                13`817 µg/g were measured in five replicates on three
The LoD was established according to CLSI guideline             different test cassette lots.
EP17-A. Two extracted stool samples with calprotectin
concentrations of 58 and 62 μg/g were diluted in extraction
buffer to obtain a total of six samples with concentrations
ranging from 1 x LoB (6.3 µg/g) to 4 x LoB (25.1 µg/g). The
samples were measured in ten replicates to obtain 60
values. The study was performed with two different test
cassette lots.

Release date: 2019-12-20                                 7/42                                    Quantum Blue® fCAL extended
DEUTSCH                                       REAGENZIEN & MATERIAL ZUSÄTZLICH
                                                                         ERHÄLTLICH
ANWENDUNGSZWECK                                                          Stuhlextraktionprodukte
Der BÜHLMANN Quantum              Blue®
                                 fCAL extended ist ein in                Extraktionsprodukte zur Stuhlextraktion werden nicht mit
vitro-Diagnosetest für die quantitative Bestimmung von                   diesem Kit mitgeliefert und müssen zusätzlich zum Kit
Calprotectin in humanen Stuhlproben, der als Hilfsmittel bei             bestellt werden.
der Beurteilung von Darmschleimhautentzündung dient.                      Extraktions-
                                                                                           Menge                        Art.-Nr.
Die Testergebnisse dienen bei der Diagnose als Hilfsmittel                produkt Kits
zur Unterscheidung zwischen organischen, entzündlichen                                     Packungen mit 50, 200 oder
Erkrankung des Magen-Darm-Traktes (entzündliche                                            500 Röhrchen erhältlich,     B-CALEX-C50
Darmerkrankungen (CED), speziell Morbus Crohn oder                        CALEX® Cap       gefüllt mit 5 mL             B-CALEX-C200
                                                                                           Extraktionspuffer            B-CALEX-C500
Colitis ulcerosa (UC)) und funktionellen Erkrankungen                                      Gebrauchsfertig
(Reizdarmsyndrom (RDS)) (Ref. 1-7) bei Patienten mit
chronischen Bauchschmerzen und als Hilfsmittel bei der                                     50 Röhrchen bestehend aus
                                                                          Smart-Prep                                    B-CAL-RD
                                                                                           Spatel und Böden
Überwachung der CED (Ref. 7-18).
Für den Laborgebrauch.                                                                     50 Röhrchen bestehend aus
                                                                                           Röhrchen, Konus und
Europa: Für den professionellen Gebrauch.                                 ScheBo® Quick-   Dosierspitze,
                                                                                                                        B-CAL-SO50
                                                                          Prep™            gefüllt mit 1.3 mL
PRINZIP DER METHODE                                                                        Extraktionspuffer
                                                                                           Gebrauchsfertig
Das Testprinzip beruht auf der selektiven Messung von                                                                              Tabelle 2
Calprotectin mittels eines Sandwich Immunoassays. Ein
monoklonaler Fangantikörper (mAk), der hoch spezifisch
                                                                         NICHT IM LIEFERUMFANG ENTHALTENE
für Calprotectin ist, wird auf eine Testmembran gebunden.
                                                                         ERFORDERLICHE MATERIALIEN
Ein zweiter monoklonaler Nachweisantikörper, welcher mit
Goldkolloiden konjugiert ist, wird auf dem „Conjugate                    • Vortex Mischer für die Stuhlextraktion
Release Pad“ aufgebracht. Nach der Zugabe der                            • Präzisionspipetten mit Einwegspitzen:             10-100 µL,
extrahierten und verdünnten Stuhlprobe wird er in das                      100-1000 µL und 250-2500 µL
Reaktions-System freigesetzt. Der Calprotectin / Anti-
Calprotectin-Goldkonjugat Komplex bindet an den auf der                  • Zentrifuge
Membran       gebundenen       Anti-Calprotectin Antikörper              • 5 mL Polypropylen oder Polystyrol Einwegröhrchen zur
(Testlinie; Testbande). Das verbleibende nicht gebundene                   Durchführung von Extraktverdünnung
Anti-Calprotectin-Goldkonjugat wird von einem Ziege-Anti-                • Laborwecker (optional)
Maus Antikörper gebunden, welcher ebenfalls auf die
Membran gebunden wurde (Kontrollinie; Kontrollbande).                    • Quantum Blue® Reader bei BÜHLMANN erhältlich
                                                                           (Art.-Nr.: BI-POCTR-ABS)
Die Signalintensität der Testbande (T) und der
Kontrollbande (C) wird durch den BÜHLMANN Quantum                        • Papiertücher und Fliesspapier
Blue® Reader quantifiziert.
                                                                         VORSICHTSMASSNAHMEN
GELIEFERTE REAGENZIEN UND VORBEREITUNG                                   Sicherheitsmassnahmen
Reagenz              Menge          Art.-Nr.       Kommentar             • Die Kontrollen enthalten Bestandteile humanen
                                                   Vakuumdicht In           Ursprungs. Obwohl sie negativ in Tests für HBV
                                    B-LFCALUS-
Testkassette         25 Stück
                                    TC
                                                   einem                    Oberflächenantigen, HCV und HIV1/2 Antikörper waren,
                                                   Folienbeutel             sollten sie gemäss Guter Laborpraxis (GLP) als
Extraktionspuffer
                     1 Flasche,
                                    B-CAL-EX       Gebrauchsfertig
                                                                            potentiell infektiös behandelt werden und die
                     125 mL                                                 entsprechenden Sicherheitsvorkehrungen getroffen
Kontrollen           2 Fläschchen, B-CALE-                                  werden.
                                                   Gebrauchsfertig
tief* / hoch*        0,5 mL        CONSET
                                                                         • Alle Patientenproben sollten gemäss Guter Laborpraxis
RFID Chipkarte       1 Stück        B-CALE-RCC
                                               Weisse                      (GLP) als potentiell infektiös behandelt werden und die
                                               Plastikkarte
                                                                           entsprechenden       Sicherheits-vorkehrungen    sollten
                                    B-CALE-        Grüne                   getroffen werden.
RFID Chipkarte       1 Stück
                                    RCC720         Plastikkarte
                                                                         • Reagenzien: Kontakt der Reagenzien mit der Haut, den
                                                             Tabelle 1
                                                                           Augen oder den Schleimhäuten vermeiden. Im Falle
* Die Kontrollen enthalten lotspezifische Konzentrationen von nativem,
humanem Calprotectin. Die genauen Konzentrationen werden auf dem           eines Kontaktes sofort mit reichlich Wasser spülen,
QC Datenblatt angegeben.                                                   ansonsten kann eine Reizung auftreten.
                                                                         • Die Reagenzien und Chemikalien müssen gemäss den
LAGERUNG UND HALTBARKEIT DER REAGENZIEN                                    nationalen    Richtlinien  und     Bestimmungen als
Sämtliche Kitkomponenten sind bei 2-8 °C bis zum                           gefährlicher Abfall behandelt werden.
angegebenen Ablaufdatum haltbar.

Release date: 2019-12-20                                          8/42                                     Quantum Blue® fCAL extended
Technische Vorsichtsmassnahmen                                Lagerung des Extraktes
                                                              Fäkales Calprotectin in Extrakten, die mit dem CALEX®
Kitkomponenten
                                                              Cap gewonnen wurden, ist bei Raumtemperatur 3 Tage
• Sämtliche Reagenzien und Proben müssen vor der              und bei 2-8 °C bis zu 6 Tage stabil. Bei längerer Lagerung,
   Testdurchführung auf Raumtemperatur (18-28 °C)             die Extrakte bei -20 °C einfrieren. Gefrorene Extrakte sind
   gebracht werden.                                           für einen Zeitraum von bis zu 23 Monaten stabil.
• Die Reagenzien vor dem Gebrauch gut mischen                 CALEX® Cap Extrakte können direkt im CALEX® Cap
  (Vortex).                                                   gelagert und gefroren werden. Die Extrakte können vier
• Die Reagenzien dürfen nach Ablauf des Verfallsdatums        Einfrier/ Auftau-Zyklen ausgesetzt werden. Vor der
                                                              Messung die gefrorenen Extrakte auf Raumtemperatur
  nicht mehr verwendet werden.
                                                              äquilibrieren lassen. Zur Weiterverwendung der Extrakte
• Mischen Sie nicht die Reagenzien verschiedener Kit          siehe Schritt 2 unter dem Kapitel Testdurchführung.
  Lots.                                                       Calprotectin-Stuhlextrakte, die mit der manuellen
• Die Testkassetten        dürfen   nicht   wiederverwendet   Wiegemethoden, wie BÜHLMANN Smart-Prep oder
  werden.                                                     ScheBo® Quick-Prep™, gewonnen wurden, sind bei 2-8 °C
                                                              für ≤7 Tage oder bei –20 °C für 36 Monate stabil.
Testablauf
• Lesen Sie die Testanleitung vor der Testdurchführung
                                                              TESTDURCHFÜHRUNG
  sorgfältig durch. Die Leistungsdaten können negativ
  beeinflusst werden, wenn Reagenzien nicht korrekt           Der Arbeitsablauf gliedert sich in drei Schritte:
  verdünnt, behandelt oder unter Bedingungen gelagert
                                                              1. Extraktion der Stuhlproben:
  werden, die von der beschriebenen Arbeitsanleitung
  abweichen.                                                      Die Extraktion ist in der Arbeitsanleitung des gewählten
• Vor Testbeginn muss der Quantum             Blue®
                                                Reader            Extraktionsröhrchens beschrieben.
  eingeschaltet und für den Quantum Blue® fCAL                    CALEX® Cap: Flüssige Stuhlproben können direkt in
  extended Test programmiert werden: Laden Sie die                das CALEX® Cap pipettiert werden. Die blaue Kappe
  Testmethode mithilfe der RFID Chipkarte (B-CALE-RCC             abschrauben und 10 µL der Stuhlprobe in das Röhrchen
  oder B-CALE-RCC720), bevor Sie den Test starten                 pipettieren. Die Kappe des CALEX® Cap wieder
  (siehe Quantum Blue® Reader Handbuch).                          aufschrauben und mit dem Vortex-Schritt gemäss dem
• Benutzen Sie die RFID Chipkarte,                um    die       Extraktionsverfahren, das in der mit dem CALEX® Cap
  testspezifischen Parameter zu ändern.                           mitgelieferten Gebrauchs-anweisung beschrieben und
                                                                  abgebildet ist, fortfahren.
• Unsachgemässe Handhabung der Patientenproben
  können zu unbrauchbaren Resultaten führen.                  2. Verarbeitung des Extraktes:
• Um verlässliche, quantitative Resultate zu erhalten, ist    • Smart-Prep oder ScheBo® Quick PrepTM: Die Extrakte
  es wichtig, dass die im Extraktionsröhrchen enthaltene        nach der Extraktion 10 Minuten ruhen lassen. Den
  Stuhlprobe vollständig homogenisiert wird.                    Überstand mit Extraktionspuffer 1:10 verdünnen (z.B.
• Es ist wichtig, dass die Extrakte im Smart-Prep oder          50 µL Extrakt + 450 µL Extraktionspuffer). Nach der
  ScheBo® Quick-Prep™ vor der Lagerung für 5 Min. bei           Verdünnung gut mischen und die Proben vor Gebrauch
  3000 x g zentrifugiert werden. Nach der Zentrifugation        für mindestens 5 Minuten bei 18-28 °C stehen lassen,
  muss der Überstand in ein frisches Röhrchen                   bevor mit dem nächsten Schritt fortgefahren wird
  transferiert werden.                                          (Schritt Nr. 3).
                                                              •   CALEX® Cap: Die Extrakte nach der Extraktion 10
PROBENENTNAHME UND LAGERUNG                                       Minuten mit dem weissen Verschluss nach unten ruhen
                                                                  lassen. Öffnen Sie den blauen Verschluss. Der
Für das Extraktionsverfahren werden weniger als 1 g native        Überstand kann dann ohne weitere Verdünnung in
Stuhlprobe benötigt. Die Stuhlproben in Röhrchen ohne             dem Lateral Flow Testablauf verwendet werden.
Zusatzstoffe füllen.
                                                              3. Lateral Flow Testablauf und Quantifizierung
Wichtiger Hinweis: Den Proben dürfen keine chemische
oder biologische Zusatzstoffe beigefügt werden.               Es können zwei alternative Methoden von der jeweiligen
                                                              RFID-Chipkarte geladen werden. B-CALE-RCC oder B-
Transport der Proben                                          CALE-RCC720. Wählen Sie eine der RFID-Chipkarten vor
Die Stuhlproben sollten innerhalb von 3 Tagen nach der        dem Start der Experimente. Laden Sie die testspezifischen
Gewinnung zur Bearbeitung im Labor eingehen. Die              Parameter von der RFID Chipkarte auf den Quantum Blue®
Stuhlproben können bei Raumtemperatur oder gekühlt            Reader.
versendet werden.
Lagerung der Proben
Die Stuhlproben sollten im Kühlschrank bei 2-8 °C
aufbewahrt und innerhalb von 3 Tagen nach Eingang im
Labor extrahiert werden. Die Proben nicht bei erhöhten
Temperaturen lagern.

Release date: 2019-12-20                               9/42                                      Quantum Blue® fCAL extended
Hinweis: Nehmen Sie das Quantum Blue® Reader Manual
                                                                zu Hilfe, wenn Sie mehr über die Basisfunktionen
3.1 Methode  mit internem Zeitmesser             (Inbetriebnahme und Bedienung) erfahren wollen,
• Verwenden Sie die grüne RFID Chipkarte.                       insbesondere wie Testmethoden ausgewählt werden und
                                                                wie lotspezifische Parameter von der RFID Chipkarte auf
• Testkassette auf den Kassettenhalter des Quantum              den Quantum Blue® Reader geladen werden.
  Blue® Readers laden.
• 60 μL verdünntes Extrakt auf die runde Proben-                QUALITÄTSKONTROLLE
  autragsstelle der Testkassette aufbringen.
                                                                • Falls die Ergebnisse des Tests nicht innerhalb der
• Den Kassettenhalter schliessen und den Startknopf
                                                                  erwarteten Bereiche liegen und wiederholte Messungen
  drücken.
                                                                  einen Durchführungsfehler ausschliessen, sind folgende
• Der Lesevorgang startet automatisch nach 12 Minuten             Bedingungen zu überprüfen: i) Pipetten, Temperatur
  (720 Sek.).                                                     und Zeitmessung, ii) Verfallsdaten der Reagenzien, iii)
• Für die Kontrollen Tief / Hoch: Wiederholen Sie den             Lagerung- und Inkubationsbedingungen.
  Schritt 3.1 mit 60 μL Kontrollen anstelle des verdünnten      • Der Selbsttest, der beim Einschalten des Quantum
  Stuhlextrakts.                                                  Blue® Readers durchgeführt wird, muss gültig sein.

                                                                VALIDIERUNG DER RESULTATE
                                                                • Damit das Testresultat als gültig bewertet wird, muss
                                                                  die Kontrollbande (C) klar ersichtlich sein (siehe
                                                                  Abbildungen 1A und 1B). Diese wird nur als
                                                                  Funktionskontrolle verwendet und kann nicht zur
                                                                  Interpretation der Testbande (T) benutzt werden. Falls
                                                                  die Testbande (T) nach 12 Minuten Inkubation nicht
                                                                  nachweisbar ist (Abbildung 1A), bedeutet dies, dass die
                                                                  Calprotectinkonzentration im Stuhl nicht nachweisbar
                                                                  ist. Falls die Testbande (T) nach der Inkubation
                                                                  nachweisbar ist, wird die Calprotectinkonzentration in
3.2 Methode  ohne internen Zeitmesser                 der Stuhlprobe durch den Quantum Blue® Reader
• Verwenden Sie die weisse RFID Chipkarte.                        berechnet.
• 60 μL verdünntes Extrakt auf die runde Proben-                • Falls nach der Inkubation von 12 Minuten nur die
  autragsstelle der Kassette aufbringen.                          Testbande (T) sichtbar ist (Abbildung 1C), ist das
• Die Testkassette für 12 +/-1 Minuten inkubieren                 Resultat ungültig und der Test muss mit einer neuen
  (einen Wecker manuell einstellen).                              Testkassette wiederholt werden.
• Testkassette auf den Kassettenhalter des Quantum              • Falls weder die Kontrollbande (C) noch die Testbande
  Blue® laden                                                     (T) nach der Inkubation nach 12 Minuten nicht
                                                                  nachweisbar sind (Abbildung 1D), ist das Resultat
• Lesevorgang durch        sofortiges   Drücken   auf   den
                                                                  ungültig und der Test muss mit einer neuen
  Startknopf starten.
                                                                  Testkassette wiederholt werden.
• Für die Kontrollen Tief / Hoch: Wiederholen Sie den
                                                                • Da der Quantum Blue® Reader eine quantitative
  Schritt 3.2 mit 60 μL Kontrollen anstelle des verdünnten
                                                                  Bestimmung der Test (T) und der Kontrollbande (C)
  Stuhlextrakts.
                                                                  erlaubt, wird eine zusätzliche Validitätsprüfung
                                                                  durchgeführt.    Falls   die    Signalintensität  der
                                                                  Kontrollbande (C) nach der Inkubation von 12 Minuten
                                                                  einen bestimmten Wert unterschreitet, ist das Resultat
                                                                  ungültig und der Test muss mit einer neuen
                                                                  Testkassette wiederholt werden.

Release date: 2019-12-20                                10/42                                  Quantum Blue® fCAL extended
STANDARDISIERUNG                                             anderen klinischen Ergebnissen            und    Laborbefunden
                                                             verfügbar sind, interpretiert werden.
• Der Quantum Blue® fCAL extended wurde mit Hilfe des
  BÜHLMANN        fCAL® ELISA    (Art.-Nr.: EK-CAL)          Klinische Schwellenwerte
  standardisiert.                                            Die folgenden Daten wurden mit dem BÜHLMANN fCAL®
• Der BÜHLMANN Quantum Blue® Reader verwendet für            ELISA erhoben (Bestellcode: EK-CAL).
  die Berechnung der Calprotectinkonzentration eine lot-     Ergebnisse aus 58 klinischen Proben von mit RDS
  spezifische Standardkurve. Der messbare Bereich liegt      diagnostizierten Patienten und aus 131 klinischen Proben
  zwischen 30 und 1000 µg/g.                                 von mit CED diagnostizierten Patienten aus einer
                                                             internationalen klinischen Studie wurden herangezogen,
• Um quantitative Ergebnisse für die Calprotectin-           um die in Tabelle 3 angegebenen Werte zu erhalten.
  konzentrationen zwischen 850-1800 μg/g zu erhalten,
  können hohe Proben, die über 850 μg/g anzeigen, mit
                                                             Calprotectin-
  dem BÜHLMANN Quantum Blue® high range Test                                  Interpretation         Nachuntersuchung
                                                             konzentration
  (Bestellcode: LF-CHR25) erneut getestet werden.
                                                             < 80 µg/g        Normal                 Keine
                                                                              Grauzone/              Nachbeobachtung innerhalb
EINSCHRÄNKUNGEN                                              80 – 160 µg/g
                                                                              grenzwertig            von 4-6 Wochen
• Die mit dem Quantum Blue® fCAL extended Kit                > 160 µg/g       Erhöht                 Bei Bedarf wiederholen
  bereitgestellten Reagenzien sind nur für die                                                                         Tabelle 3
  Bestimmung      der Calprotectinkonzentrationen in         Calprotectinwerte unterhalb 80 μg/g
  humanen Stuhlproben vorgesehen.                            Calprotectinwerte im Stuhl 160 µg/g deuten auf eine
  Aufmerksamkeit auf Resultate oberhalb von 300 μg/g zu      neutrophile Infiltration des gastrointestinalen Traktes hin;
  legen, wenn sie mit starken Symptomen einhergehen,         daher kann dies ein Zeichen dafür sein, dass eine aktive
  was eine akute Entzündung anzeigen könnte. In diesem       entzündliche      Erkrankung     vorliegt.    Entsprechende
  Falle wird für die Bestätigung eine zeitnahe erneute       weiterführende Untersuchungen durch Fachärzte zur
  Messung der Patientenstuhlprobe empfohlen.                 Erhaltung einer klinischen Gesamtdiagnose werden
• Patienten, die regelmässig NSAID einnehmen, könnten        empfohlen.
  erhöhte fäkale Calprotectinkonzentrationen aufweisen.
                                                             Klinische Beurteilung
• Die Ergebnisse sind unter Umständen nicht klinisch         Die Fähigkeit des BÜHLMANN fCAL® ELISA zwischen
  anwendbar auf Kinder unter 4 Jahren, die leicht erhöhte    Patienten mit CED und anderen nichtentzündlichen GI-
  Calprotectinspiegel im Stuhl aufweisen (Ref. 21-24).       Erkrankungen einschliesslich RDS zu unterscheiden,
                                                             wurde in einer klinischen Studie mit insgesamt 337
INTERPRETATION DER ERGEBNISSE                                erwachsenen und pädiatrischen Patienten untersucht.
I. Unterscheiden einer organischen Erkrankung von            Einhundertfünfunddreissig (135) Patienten hatten die
einer funktionellen gastrointestinalen Erkrankung            endgültige Diagnose einer CED (Morbus Crohn, Colitis
                                                             ulcerosa oder unklare Colitis), 130 Patienten hatten RDS
Die Bestimmung des Calprotectinspiegels in Stuhlproben       und 72 Patienten stellten sich mit Bauchschmerzen
kann als zuverlässige und einfache Hilfe bei der             und/oder     Durchfall  bzw.    anderen    GI-assoziierten
Unterscheidung zwischen organischen und funktionellen        nichtentzündlichen Erkrankungen vor (siehe Tabelle 4). Die
gastrointestinalen Erkrankungen verwendet werden             endgültige Diagnose wurde durch Endoskopie sowie
(Ref. 1-7).                                                  andere klinische Befunde gestützt.
Die Ergebniskategorien basieren auf Daten aus klinischen
                                                             Die Differenzierung zwischen CED und GI-assoziierten
Studien, die von BÜHLMANN durchgeführt wurden, und
                                                             nichtentzündlichen Erkrankungen einschliesslich RDS
sind Empfehlungen von BÜHLMANN. Alle Testergebnisse
                                                             wurde mit einer klinischen Empfindlichkeit von 93,3% bei
sollten zusammen mit Informationen, die aus den
                                                             80 µg/g und einer klinischen Spezifität von 83,7% bei
klinischen Symptomen des Patienten, der Anamnese und
Release date: 2019-12-20                             11/42                                     Quantum Blue® fCAL extended
160 µg/g erreicht. Die ROC-Kurvenanalyse ergab einen           LEISTUNGSMERKMALE
AUC von 0,923 (siehe Tabelle 5).
                                                               Methodenvergleich
Die Differenzierung zwischen CED und RDS wurde mit
einer klinischen Empfindlichkeit von 93,3% bei 80 µg/g und     Bias an den klinischen Entscheidungspunkten:
einer klinischen Spezifität von 85,4% bei 160 µg/g erreicht.   50 μg/g: 10,6% (95% CI: -2,1-36%)
Die ROC-Kurvenanalyse ergab einen AUC von 0,933                200 μg/g: -2,2% (95% CI: -4,9-4,7%)
(siehe Tabelle 6).                                             100 μg/g: 2,1% (95% CI: -2,7-14%)
Die durch ROC-Analyse definierte optimale Kombination          300 μg/g: -3,6% (95% CI: -7,0-2,3%)
von Toleranzgrenzen für diese Patientenpopulationen            Die Methodenvergleichsstudie wurde gemäss der CLSI-
betrug 80 µg/g und 160 µg/g Calprotectin, welches etwas        Richtlinie            EP09-A3            durchgeführt.
stringenter ist als die Kombination einer empfindlicheren      Einhundertsechsundachzig 186 extrahierte klinische
unteren Toleranzgrenze von 50 µg/g mit geringerer              Stuhlproben wurden entsprechend der Gebrauchs-
Spezifitätsleistung und einer oberen Toleranzgrenze von        anweisung mit dem Quantum Blue® fCAL extended und
200 µg/g      mit    etwas    geringerer   Empfindlichkeit     dem BÜHMANN fCAL® ELISA Test gemessen. Die
(Tabelle 7 und 8).                                             Messungen wurden an drei Tagen mit drei Testkassetten-
                                                               Lots für den Quantum Blue® fCAL extended Test
II. CED-Überwachung                                            durchgeführt (Abbildung 2).
Klinische Schwellenwerte und Beurteilung                       Wiederfindung: 102%-121%
Die Bestimmung von Calprotectin im Stuhl ist eine              Sechs    Stuhlprobenextrakte    wurden   mit  150 μg/g
zuverlässige und einfache Hilfe bei der Überwachung von        Calprotectin in Kalibratormaterial aus humanem Serum
CED-Patienten (Ref. 7-18).                                     aufgestockt. Das ursprüngliche Extrakt wurde mit der
Die Korrelation von Calprotectin-Spiegeln und dem              entsprechenden Menge an Extraktionspuffer aufgestockt.
Entzündungszustand der Darmschleimhaut von Patienten           Ursprüngliche und aufgestockte Proben wurden in acht
gemäss endoskopischer Untersuchungen wurde in drei             Replikaten gemessen. Es wurde ein Testkassetten-Lot
unabhängigen       Studien    mithilfe von   BÜHLMANN          verwendet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 11
Calprotectin Tests bestimmt (Tabelle 9).                       zusammengestellt.
Die diagnostische Aussagekraft von Calprotectin bei der
Vorhersage von klinischen Remissionen und Rezidiven            Präzision (Wiederholbarkeit): 15,3-19,1% CV
gemäss         Patientensymptomen,       die    klinischen
                                                               Präzision innerhalb des Labors (within-laboratory
Aktivitätsindizes sowie der ungeplante Bedarf für eine
                                                               precision): 18,0-23,0% CV
Therapieeskalation, Hospitalisierung oder einen Notfall
wurde in drei Studien mithilfe von BÜHLMANN Calprotectin       Die Wiederholpräzision und Präzision innerhalb des Labors
Tests bestimmt (Tabelle 10).                                   wurden nach der CLSI-Richtlinie EP05-A2 durchgeführt.
Die dargestellten Ergebniskategorien sind Empfehlungen         Vier extrahierte Stuhlproben, einschliesslich Extrakten mit
und ihre Erstellung basiert auf den zusammengefassten          Calprotectinwerten nahe an klinischen Entscheidungs-
Erkenntnissen der publizierten Toleranzgrenzen und             punkten, wurden über 10 Tage in zwei unabhängigen
klinischen Leistungsstudien. Es ist angeraten, dass Ärzte      Testläufen täglich mit zwei Replikaten pro Messung
individuelle Patienten-Schwellenwerte durch Bestimmung         gemessen. Dabei wurde ein einzelnes Reagenzienlot
des Calprotectin-Spiegelausgangswerts des Patienten            verwendet (Tabelle 12).
während der Krankheitsremission festlegen.                     Inter-Lot-Präzision: 16,5-20,6% CV
Calprotectin-Werte unterhalb 100 μg/g                          Die Inter-Lot-Präzision wurde gemäss der CLSI-Richtlinie
Calprotectin-Spiegel im Stuhl unterhalb 100 µg/g können        EP05-A2 durchgeführt. Vier extrahierte Stuhlproben,
Patienten mit niedrigem Risiko eines klinischem Rezidivs in    einschliesslich Extrakten mit Calprotectinkonzentrationen
endoskopischer Remission verlässlich identifizieren.           nahe an klinischen Entscheidungspunkten, wurden mit drei
Invasive endoskopische Verfahren können bei diesen             unterschiedlichen     Reagenzienlots   gemessen.      Die
Patienten vermieden werden (Ref. 7-18).                        Messungen wurden über fünf Tage in einem Testlauf
                                                               täglich mit zwei Replikaten pro Messung durchgeführt
Calprotectinwerte zwischen 100 und 300 μg/g                    (Tabelle 13).
Calprotectin-Spiegel im Stuhl von 100 bis 300 µg/g können
                                                               Limit of Blank (LoB): 6,7 µg/g Calprotectin.
auf die Notwendigkeit einer engmaschigeren Überwachung
im folgenden Zeitraum hinweisen, um Tendenzen der              Der LoB-Wert wurde gemäss der CLSI-Richtlinie EP17-A
Krankheitsentwicklung zu beurteilen.                           mit Extraktionspuffer bestimmt um 60 Blankwerte zu
                                                               erhalten. Die Studie wurde mit zwei Testkassetten-Lots
Calprotectinwerte oberhalb 300 μg/g                            durchgeführt.
Bei Calprotectinspiegeln im Stuhl von über 300 µg/g sollte
                                                               Limit of Detection (LoD): 18 µg/g Calprotectin.
die Bestimmung wiederholt und bei Bestätigung erhöhter
Spiegel weitere Untersuchungsverfahren veranlasst              Der LoD-Wert wurden gemäss der CLSI-Richtlinie EP17-A
werden (Ref. 7-18).                                            bestimmt.     Zwei      extrahierte  Stuhlproben     mit
                                                               Calprotectinkonzentrationen von 58 und 62 µg/g wurden in
                                                               Extraktionspuffer verdünnt, um insgesamt sechs Proben
                                                               mit Konzentrationen zwischen 1 x LoB (6,3 µg/g) und 4 x
                                                               LoB (25,1 µg/g) zu erhalten. Die Proben wurden in zehn

Release date: 2019-12-20                               12/42                                   Quantum Blue® fCAL extended
Replikaten gemessen um 60 Werte zu erhalten. Die Studie
wurde mit zwei Testkassetten-Lots durchgeführt.
Limit of Quantification (LoQ)
Unterer LoQ: ≤30 (28,2) µg/g Calprotectin.
Oberer LoQ: ≥1000 (1002) µg/g Calprotectin.
Der LoQ-Wert wurde gemäss der CLSI-Richtlinie EP17-A
bestimmt. Um den unteren LoQ-Wert zu bestimmen,
wurden vier extrahierte Stuhlproben mit Calprotectin-
konzentrationen zwischen 19,1 und 37,3 µg/g in zehn
Replikaten gemessen um 40 Werte zu erhalten
(Tabelle 14). Um den oberen LoQ-Wert zu bestimmen,
wurden         fünf     extrahierte    Stuhlproben       mit
Calprotectinkonzentrationen zwischen 628 und 1001,7 µg/g
in zehn Replikaten gemessen um 40 Werte zu erhalten
(Tabelle 15). Die Studie wurde mit zwei Testkassetten-Lots
durchgeführt. Referenzwerte für Calprotectin für die
extrahierten Stuhlproben wurden mit dem BÜHLMANN
fCAL® ELISA bestimmt. Unter Verwendung des RMS-
Modells,        das     aus     den     Präzisions-     und
Abweichungsschätzungen für jede Probe hervorging,
wurde der relative Gesamtfehler berechnet. Der LoQ wurde
als die niedrigste und höchste Probenkonzentration
definiert, für den unteren und oberen LoQ-Wert, der für das
Akzeptanzkriterium von 30% relativen Gesamtfehlers
erhalten wurde.
Linearität: 30-850 μg/g
Der lineare Bereich des Quantum Blue® fCAL extended
Tests wurde gemäss der CLSI-Richtlinie EP06-A
durchgeführt. Um insgesamt 14 Konzentrationsstufen zu
erhalten, die den erwarteten Messbereich abdecken und
höher sind, wurden zwei extrahierte Stuhlproben, mit
niedriger und hoher Calprotectinkonzentration, gemischt.
Die Mischungen wurden mit jeweils zehn Replikaten auf
zwei Testkassetten-Lots gemessen. Gemittelte Werte der
Calprotectinkonzentrationen wurden für jede Mischung
gegen den Verdünnungsfaktor aufgetragen, der zur
Herstellung der Mischungen verwendet wurde. Es wurde
sowohl eine lineare Anpassung als auch eine polynomiale
Anpassung zweiter und dritter Ordnung angewendet. Wenn
Koeffizienten der polynomialen Anpassung eines Polynoms
der zweiten und dritten Ordnung als signifikant bestimmt
wurden, wurde der lineare Bereich als das Intervall der
Calprotectinkonzentration    bestimmt,  in   dem     eine
Abweichung von der linearen Anpassung, 20% des
relativen   Konzentrationswerts    bzw.   20 μg/g   nicht
überschreitet (Abbildung 3).
High-Dose-Hook Effekt
Bei Calprotectinkonzentrationen bis zu 1500 µg/g wurde
kein High-Dose-Hook Effekt beobachtet. Eine Abnahme
des gemittelten Signals unter die obere lineare
Bereichslimite von 850 μg/g wurde für Calprotectin-
konzentrationen über 4000 μg/g abgeschätzt.
Es wurde für keines der einzelnen Replikatmessungen ein
Wert unterhalb des höchsten klinischen Entscheidungs-
punktes von 300 µg/g beobachtet. Sieben bis acht
extrahierte Stuhlproben mit Calprotectinkonzentrationen
zwischen 1361 µg/g und 13`817 µg/g wurden in fünf
Replikaten auf drei Testkassetten-Lots gemessen.

Release date: 2019-12-20                               13/42   Quantum Blue® fCAL extended
FRANÇAIS                                         STOCKAGE ET DUREE DE CONSERVATION
                                                                            DES RÉACTIFS
UTILISATION PRÉVUE                                                          Tous les composants du kit sont stables à 2-8 °C jusqu'à la
Le BÜHLMANN Quantum                Blue®
                                   fCAL extended est un test                date d’expiration imprimée sur les étiquettes.
de diagnostic in vitro pour la détermination quantitative de
la calprotectine dans les prélèvements de selles humains                    REACTIFS ET MATERIEL FOURNIS SELON
destiné à aider à l’évaluation de l’inflammation de la                      LA DEMANDE
muqueuse intestinale. Les résultats du dosage peuvent
                                                                            Dispositifs d'extraction de selles
aider au diagnostic différenciant une maladie inflammatoire
organique      du     tractus    gastro-intestinal    (maladie              Les tubes d'extraction de selles décrits ci-après ne sont
inflammatoire     chronique     de    l’intestin   ou   MICI,               pas inclus dans le kit. Ils peuvent être commandés en
spécifiquement maladie de Crohn ou rectocolite                              même temps que le kit.
hémorragique, RCH) d'une maladie fonctionnelle                               Kits de dispositifs
                                                                                                   Quantité                   Code
(syndrome du côlon irritable ou SCI) (réf. 1-7), chez les                    d’extraction
patients souffrant de douleurs abdominales chroniques et                                           Paquets de 50, 200 ou
peuvent également aider au suivi d’une MICI (réf. 7-18).                                           500 tubes disponibles,     B-CALEX-C50
                                                                             Tube d’extraction     chaque tube contenant
Pour utilisation en laboratoire uniquement.                                  CALEX® Cap            5 mL de tampon             B-CALEX-C200
Europe : pour utilisation professionnelle.                                                         d’extraction               B-CALEX-C500
                                                                                                   Prêt à l'emploi
PRINCIPE DU TEST                                                                                   50 tubes, comprenant
                                                                             Smart-Prep            chacun spatules et fonds   B-CAL-RD
Le test permet la mesure sélective de l'antigène de la                                             de tube
calprotectine par un dosage immunologique de type                                                  50 tubes constitués d’un
sandwich. Un anticorps monoclonal de capture (mAb)                                                 tube, d’un cône et d’un
hautement spécifique de la calprotectine est déposé sur la                   ScheBo® Quick-        embout doseur, chacun
                                                                                                   rempli de 1,3 mL de        B-CAL-SO50
membrane test. Un second anticorps monoclonal, conjugué                      PrepTM
                                                                                                   tampon d’extraction
à de l’or colloïdal permettant la détection, est présent sur la
                                                                                                   Prêt à l'emploi
bande de libération du conjugué. Il est libéré dans le
système après ajout de l'échantillon de selle extrait et dilué.                                                                      Tableau 2
Le conjugué calprotectine/anti-calprotectine-or se lie à
l'anticorps anti-calprotectine déposé sur la membrane test                  MATERIEL REQUIS MAIS NON FOURNI
(ligne test) et le restant du conjugué or anti-calprotectine                • Vortex pour l’extraction des selles
qui n’a pas réagi se lie à l'anticorps de chèvre anti-souris
déposé sur la membrane test (ligne contrôle). Les                           • Pipettes de précision avec pointes jetables : 10-100 µL,
intensités de signal de la ligne de test (T) et de la ligne de                100-1000 µL et 250-2500 µL
contrôle (C) sont mesurées quantitativement par le                          • Centrifugeuse
BÜHLMANN Quantum Blue® Reader.                                              • Tubes jetables en polypropylène ou polystyrène de
                                                                              5 mL pour la préparation des dilutions d’échantillons
REACTIFS FOURNIS ET PREPARATION                                             • Minuteur (facultatif)
Réactifs                Quantité     Code              Commentaires         • Quantum Blue® Reader disponible chez BÜHLMANN
                                                       Scellée sous           (code de commande : BI-POCTR-ABS)
Cassette test           25 pièces    B-LFCALUS-TC      vide dans un
                                                       sachet               • Papier absorbant
                        1 flacon
Tampon d’extraction
                        125 mL
                                     B-CAL-EX          Prêt à l'emploi      PRECAUTIONS
Contrôles               2 flacons,                                          Précautions de sécurité
                                     B-CALE-CONSET Prêts à l’emploi
bas* / élevé*           0,5 mL                                              • Les contrôles de cette trousse contiennent des
                                                       Carte en                composants d’origine humaine. Bien que les tests de
Carte à puce RFID       1 pièce      B-CALE-RCC        plastique               détection de l’antigène de surface du VHB et des
                                                       blanche
                                                                               anticorps des virus VHC et VIH1/2 se soient révélés
                                                       Carte en
                                                                               négatifs, il convient de considérer les réactifs comme
Carte à puce RFID       1 pièce      B-CALE-RCC720     plastique
                                                       verte
                                                                               capables de transmettre des maladies infectieuses, et
                                                                               de les manipuler conformément aux Bonnes Pratiques
                                                              Tableau 1
* Les concentrations en calprotectine humaine native des contrôles
                                                                               de Laboratoire (BPL), en prenant les précautions
varient en fonction des lots. Vous référer à la fiche de contrôle qualité      appropriées.
pour les concentrations effectives.                                         • Les échantillons des patients doivent être manipulés en
                                                                              respectant les Bonnes Pratiques de Laboratoire (BPL)
                                                                              et avec les précautions requises, comme s'ils étaient
                                                                              susceptibles de transmettre des infections.
                                                                            • Réactifs : Éviter le contact des réactifs avec la peau, les
                                                                              yeux ou les muqueuses. En cas de contact, laver

Release date: 2019-12-20                                            14/42                                         Quantum Blue® fCAL extended
immédiatement et abondamment à l’eau pour éviter tout           Conservation des extraits
   risque d’irritation.                                            Les extraits de calprotectine fécale obtenus avec le
• Traiter les réactifs et les produits chimiques comme des         dispositif CALEX® Cap sont stables à température
  déchets dangereux conformément aux lignes directrices            ambiante pendant 3 jours et à 2-8 °C jusqu’à 6 jours. Pour
  ou aux réglementations de sécurité nationales relatives          un stockage plus long, congelez les extraits à
  aux substances présentant un risque biologique.                  -20 °C. Les extraits congelés sont stables pendant une
                                                                   durée pouvant aller jusqu’à 23 mois.
Précautions techniques                                             Les extraits CALEX® Cap peuvent être directement stockés
Composants du kit                                                  et congelés dans le dispositif CALEX® Cap. Les extraits
• Tous les réactifs et échantillons à tester doivent être          peuvent être soumis à quatre cycles de congélation-
  équilibrés à température ambiante (18-28 °C) avant de            décongélation. Avant la mesure, laisser les extraits
  démarrer le dosage.                                              congelés s’équilibrer à température ambiante. Pour la
                                                                   réutilisation / réévaluation des extraits voir l'étape 2 dans le
• Bien mélanger (vortex) les réactifs avant utilisation.
                                                                   chapitre procédure de dosage.
• Les constituants ne doivent pas être utilisés au-delà de         La calprotectine dans les extraits obtenus au moyen de la
  la date d'expiration imprimée sur les étiquettes.                méthode par pesée manuelle ou au moyen des dispositifs
• Ne pas mélanger des réactifs de lots différents.                 BÜHLMANN Smart-Prep ou ScheBo® Quick-Prep™ est
• Les cassettes test sont à usage unique.                          stable à 2-8 °C pendant ≤ 7 jours et à -20 °C pendant
                                                                   36 mois.
Procédure de test
• Lire attentivement les instructions avant d'effectuer le         PROCEDURE DE DOSAGE
  test. Les performances du test peuvent se dégrader en
  cas de dilution incorrecte des réactifs, ou bien si ces          La procédure de dosage se déroule en trois étapes :
  derniers sont manipulés ou stockés dans des conditions           1. Extraction des échantillons de selles :
  autres que celles spécifiées.                                       La procédure d’extraction est décrite dans le manuel
• Le Quantum Blue® Reader doit être allumé et                         d’utilisation fourni avec les tubes d’extraction respectifs.
  programmé pour le Quantum Blue® fCAL extended :                     Dispositif CALEX® Cap : Les échantillons de selles
  charger la méthode de dosage au moyen de la carte à                 liquides peuvent être directement pipetés dans le
  puce RFID (B-CALE-RCC ou B-CALE-RCC720) , avant                     dispositif CALEX® Cap. Dévisser le bouchon bleu et
  de commencer le dosage (cf. manuel du Quantum                       pipeter 10 µL d’échantillon de selles dans le dispositif.
  Blue® Reader).                                                      Reboucher le dispositif CALEX® Cap et passer à l’étape
• Utiliser la carte à puce RFID pour modifier les                     d’homogénéi-sation au vortex conformément à la
  paramètres du test spécifiques pour chaque lot.                     procédure d’extraction décrite et illustrée dans les
                                                                      instructions d’utilisation livrées avec le dispositif
• Une manipulation incorrecte des échantillons à tester
                                                                      CALEX® Cap.
  peut entraîner de faux résultats.
• Afin d’obtenir des résultats fiables et quantitatifs, il est     2. Préparation des extraits :
  important d'homogénéiser l'échantillon de selle en               • Smart-Prep ou ScheBo® Quick Prep™ : après
  totalité dans le dispositif d’extraction.                           extraction, laisser les extraits reposer pendant 10
• Il est important de centrifuger les extraits avec Smart-            minutes. Diluer le surnageant au 1/10ème avec du
  Prep ou ScheBo® Quick-PrepTM avant de les conserver,                tampon d’extraction (par exemple : 50 µL d’extrait et
  5 min à 3000 x g. Après centrifugation, le surnageant               450 µL de tampon d’extraction) et bien homogénéiser.
  doit être transféré dans un nouveau tube frais de                   Laisser les échantillons reposer pendant au moins 5
  conservation.                                                       minutes à température ambiante (18-28 °C) avant de
                                                                      procéder à la prochaine étape (étape 3).
PRÉLÈVEMENT ET STOCKAGE DES                                        • Tube d’extraction CALEX® Cap            : après extraction,
ÉCHANTILLONS                                                         laisser reposer les extraits pendant    10 minutes, embout
                                                                     blanc vers le bas. Dévisser le           bouchon bleu. Le
Moins de 1 g d’échantillon primaire de selles est exigé par          surnageant peut être utilisé sans        autre dilution dans
la procédure d’extraction. Récupérer l’échantillon de selles         l'essai en flux latéral.
dans des tubes ordinaires.
                                                                   3. Dosage en flux latéral et lecture du résultat
Important : l’échantillon doit être collecté sans adjonction
de quelque additif chimique ou biologique que ce soit.             Deux méthodes alternatives peuvent être chargées de la
                                                                   carte à puce RFID respective < B-CALE-RCC > et
Transport des échantillons                                         < B-CALE-RCC720 >. Sélectionner l'une des cartes à puce
Les échantillons de selles doivent être reçus par le               RFID avant de procéder au test.
laboratoire en charge du traitement dans les 3 jours qui           Charger les paramètres spécifiques au lot de réactif au
suivent la collecte. Les échantillons de selles peuvent être
                                                                   moyen de la carte à puce RFID sur le Quantum Blue®
expédiés à température ambiante ou réfrigérés.
                                                                   Reader.
Conservation des échantillons
Les échantillons de selles doivent être réfrigérés à 2-8 °C
et extraits dans les 3 jours qui suivent leur réception par le
laboratoire. Ne pas stocker les échantillons à des
températures élevées.
Release date: 2019-12-20                                   15/42                                      Quantum Blue® fCAL extended
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