BÜHLMANN fCAL - BÜHLMANN Laboratories AG

 
BÜHLMANN fCAL®

                                           ELISA
                                         Calprotectin

                                        EK-CAL             96 tests
                                        EK-CAL2          192 tests

                                        Revision date: 2018-04-10

BÜHLMANN Laboratories AG                    English     page      3
Baselstrasse 55                             Deutsch     page     10
4124 Schönenbuch, Switzerland               Français    page     18
Tel.: +41 61 487 1212                       Italiano    page     26
Fax: +41 61 487 1234                        Español     page     34
info@buhlmannlabs.ch                        Português   page     42
Revision date:   2018-04-10   2/60   BÜHLMANN fCAL®ELISA
Quantity
                                                                                Reagents                                       Code              Reconstitution
                                ENGLISH                                                               EK-CAL      EK-CAL2
                                                                                Control Low /
INTENDED USE                                                                    High3)             2 vials        2 vials      B-CAL-
                                                                                                                                                 Ready to use
                                                                                Human serum        x 1 mL         x 1 mL       CONSET
The BÜHLMANN           fCAL®
                         ELISA is an in vitro diagnostic test                   with preservatives
for the quantitative determination of calprotectin in human
                                                                                Enzyme Label
stool specimens intended as an aid to the assessment of                         Anti-calprotectin     1 vial      2 vials
intestinal mucosal inflammation. The assay results can be                                                                      B-CAL-EL          Ready to use
                                                                                Ab conjugated to      x 12 mL     x 12 mL
used as an aid to diagnosis in distinguishing organic,                          HRP
inflammatory disease of the gastrointestinal tract                              TMB Substrate
                                                                                                      1 vial      2 vials
(inflammatory bowel disease, IBD, e.g. Crohn’s disease or                       TMB in citrate                                 B-TMB12           Ready to use
                                                                                                      x 12 mL     x 12 mL
ulcerative colitis, UC) from functional disease (irritable                      buffer
bowel syndrome, IBS) (ref. 1-7), in patients with chronic                       Stop Solution
                                                                                                      1 vial      2 vials                        Ready to use
abdominal pain, above the age of four (ref. 8-9), and as an                     0.25 M sulfuric                   x 12 mL
                                                                                                                               B-STS12
                                                                                                      x 12 mL                                    Corrosive agent
aid to IBD disease monitoring (ref. 10-20).                                     acid

For laboratory use only.                                                                                                                                  Table 1
                                                                               1)
                                                                                    The actual calprotectin concentration of the standards A to E are 4, 12,
PRINCIPLE OF THE ASSAY                                                              40, 120 and 240 ng/mL, respectively. For extraction and subsequent
                                                                                    sample dilution, a dilution of 1:2500 was taken into account for the
The BÜHLMANN fCAL® ELISA allows the selective                                       assignment of calibrator A to E. For the lower range ELISA procedure
measurement of calprotectin in fecal extracts by sandwich                           the calibrator values have to be set as: 10, 30, 100, 300 and 600 µg/g
ELISA. The microtiter plate of the BÜHLMANN fCAL®                                   calprotectin.
                                                                               2)
                                                                                    If you choose the extended range ELISA procedure the nominal
ELISA is coated with a monoclonal capture antibody (mAb)                            calibrator values have to be set as: 30, 90, 300, 900 and 1800 µg/g
highly specific to the calprotectin heterodimeric and                               calprotectin.
polymeric complexes. Patient fecal sample extracts,                            3)
                                                                                    The controls contain lot specific amounts of native human calprotectin.
controls for determination of ELISA run acceptability, and                          Refer to the additional QC data sheet for actual concentrations.
calibrators are loaded onto wells of the microtiter plate.
After a 30 minute incubation at room temperature and                           STORAGE AND SHELF LIFE OF REAGENTS
washing steps, a detection antibody (Ab) conjugated to
                                                                               Unopened reagents
horseradish peroxidase (HRP) detects the calprotectin
                                                                               Store at 2-8 °C. Do not use the reagents beyond the expiration date
molecules bound to the capture antibody on the plate. After
                                                                               printed on the labels.
incubation and further washing steps, the chromogenic
                                                                               Opened / Reconstituted reagents
HRP substrate, tetramethylbenzidine (TMB) is added (blue
color formation) followed by a stopping reaction (change to                    Extraction Buffer        Store at 2-8 °C until expiration date.
yellow color). The absorption is measured at 450 nm. The                                                Return unused strips immediately to the foil
final calprotectin concentration in µg/g stool in the patient                                           pouch containing the desiccant packs and reseal
                                                                               Microtiter Plate         along the entire edge of zip-seal.
samples is determined using the calibration curve
                                                                                                        Store until expiration date at 2-8 °C.
generated from the measured calibrator values.
                                                                               Diluted Wash Buffer      Store for up to 6 months at 2-8 °C.
REAGENTS SUPPLIED AND PREPARATION                                              Incubation Buffer
                     Quantity                                                  Calibrators
Reagents                                      Code       Reconstitution
                     EK-CAL       EK-CAL2                                      Controls
                                                                                                        Store at 2-8 °C until expiration date.
Extraction           3 bottles    6 bottles                                    Enzyme Label
                                              B-CAL-EX   Ready to use
Buffer               x 125 mL     x 125 mL                                     TMB Substrate
Microtiter Plate                                                               Stop Solution
precoated with       12 x 8       2 x 12 x 8
                                             B-CAL-MP    Ready to use                                                                                   Table 2
anti-calprotectin    wells        wells
mAb
Plate Sealer         3 pieces     6 pieces           -   Ready to use
Wash Buffer
                     1 bottle     2 bottles              Dilute each with
Concentrate
                                              B-CAL-WB   900 mL of
(10x) with           x 100 mL     x 100 mL               deionized H2O
preservatives
Incubation
                   2 bottles      3 bottles
Buffer                                        B-CAL-IB   Ready to use
                   x 125 mL       x 125 mL
with preservatives
Calibrators
A to E1) 2)
                     5 vials      5 vials     B-CAL-
Calprotectin in a                                        Ready to use
                     x 1 mL       x 1 mL      CASET
buffer matrix with
preservatives

Revision date:       2018-04-10                                         3/60                                                    BÜHLMANN fCAL® ELISA
• Stop solution: The stop solution (B-STS12) contains
REAGENTS AND MATERIALS SUPPLIED                                                sulfuric acid (0.25 M). The reagent is an irritant to eyes,
SUPPLEMENTARY                                                                  skin and mucous membranes. Avoid contact with eyes,
                                                                               skin and clothes. After contact with eyes or skin, wash
Fecal extraction devices                                                       immediately with plenty of water.
Fecal extraction devices described in table 3 are not
delivered with the kit and either of them has to be ordered                  • Reagents: Avoid contact of reagents with the skin, eyes,
with the kit.                                                                  or mucous membranes. If contact does occur,
                                                                               immediately wash with generous amounts of water;
 Extraction                                                                    otherwise, irritation / burns can occur.
                     Quantity                         Code
 Devices
                     Package with 50, 200 or 500
                                                                             • Unused solution should be disposed of according to
        ®
                                                      B-CALEX-C50              local state and federal regulations.
 CALEX Cap           tubes respectively, each
                                                      B-CALEX-C200
 Device              filled with extraction buffer,
                                                      B-CALEX-C500           Technical precautions
                     5 mL / ready to use

                     50 tubes, spatulas, and base
                                                                             Kit components
 Smart-Prep                                           B-CAL-RD
                     caps                                                    • Residues in the microtiter plate wells result from the
                                                                               production process. They are removed in the washing
                     50 tubes consisting of tube,                              step (assay procedure step 3) and do not affect the
 ScheBo® Quick-      cone & dosing tip,               B-CAL-SO50
 PrepTM                                                                        results.
                     1.3 mL / ready to use
                                                                             • Read carefully the instructions prior to carrying out the
                                                                 Table 3       test. Test performance will be adversely affected, if
                                                                               reagents are incorrectly diluted, modified or stored under
MATERIALS REQUIRED BUT NOT PROVIDED                                            conditions other than those as detailed in this instruction
Extraction procedure                                                           for use.
• 10 µL disposable inoculation loops                                         • Components must not be used after the expiry date
                                                                               printed on the labels.
• 15 mL polypropylene tubes with screw caps required for
  standard extraction procedure; extraction devices (see                     • Do not mix different lots of reagents.
  above).                                                                    • Every effort should be made to ensure that no cross
• Laminar flow work station                                                    contamination occurs between reagents, samples or
                                                                               between wells.
• Multi tube vortex mixer
                                                                             • Allow the reagents to equilibrate to room temperature.
• Precision balance (10-150 mg)                                                Mix well (vortex) the reagents before use.
• Micro centrifuge (≥3000 x g)                                               • Microwells cannot be re-used.
• Centrifuge (≥500 x g)
                                                                             Extraction
ELISA procedure                                                              • In order to receive reliable and quantitative results it is
• 10, 100 and 1000 µL precision pipettes with disposable                        important to homogenize the stool sample entirely in the
  tips                                                                          exctraction device. Contaminations at the top of the
• Disposable polystyrene or polypropylene tubes for the                         extraction tube should be avoided. Insoluable
  preparation of sample dilutions                                               (undigested) components may still be present after
                                                                                extraction.
• 1000 mL cylinder to dilute the wash buffer
• Microtiter plate washer (see Technical Precautions) or                     ELISA procedure
  squeeze bottle for wash buffer                                             • In the ELISA procedure the washing step is essential to
• Microtiter plate rotator (see Technical Precautions)                          guarantee reproducible results. A minimal incubation
                                                                                time of the wash buffer in the wells of at least 20
• Blotting paper                                                                seconds must be ensured each time.
• Microtiter plate reader for measurement of absorbance                      • When using an automated washer, BÜHLMANN strongly
  at 450 nm                                                                    recommends using “plate mode” i.e. each process step
                                                                               (dispense/aspiration) is performed on all of the strips
PRECAUTIONS                                                                    sequentially, before proceeding to the next process step.
Safety precautions                                                             Thus, the minimal incubation time is guaranteed.
• The calibrators and controls of this test contain                          • The indicated number of washing cycles is mandatory to
   components of human origin. Although tested and found                       ensure reproducible results.
   negative for HBV surface antigen, HCV and HIV1/2                          • Set the plate rotator (shaker) at 450 rpm (
• To ensure a complete antigen/antibody interaction, the           6. Transfer the homogenate into a 2 mL Eppendorf tube
  incubation time in step 5 must be at least 30 minutes.              and centrifuge in a microcentrifuge for 5 minutes at
  Moderately longer incubation time (up to 5 minutes ) has            3000 x g.
  no influence on the final outcome.                               7. Take the supernatant into a fresh, labeled tube and
• The enzyme label is inactivated by oxygen and is highly             continue with the ELISA procedure.
  sensitive to sodium azide, thimerosal, hypochlorous acid         Extraction procedures using fecal extraction devices:
  and aromatic chlorohydrocarbons often found in                   The extraction procedure is described and illustrated in the
  laboratory water supplies. Therefore, use only deionized         instruction for use delivered with the respective extraction
  high quality water.                                              device.
• A new standard curve must be generated each time the
                                                                   1. CALEX® Cap Device (Code B-CALEX-C50 / B-CALEX-
  assay is performed.
                                                                      C200 / B-CALEX-C500): The extraction tubes are
• If the initial concentration of an unknown sample reads             prefilled with extraction buffer.
  above the concentration of the highest calibrator,
                                                                   Important: After extraction, centrifuge the CALEX® Cap
  calibrator E, the sample must be further diluted with
                                                                   Device for 5 minutes at 500-3000 x g and continue with the
  incubation buffer and assayed again according to the
                                                                   assay procedure.
  assay procedure. The resulting total dilution factor must
  be taken into account for the calculation of results.            2. Fecal extraction device Roche (Code 10745804322) or
                                                                      BÜHLMANN Smart-Prep (Code: B-CAL-RD).
SPECIMEN COLLECTION AND STORAGE                                    3. ScheBo® Quick-PrepTM (Code B-CAL-SO50):                  The
If the extraction devices are used, less than 1 g of native           extraction tubes are prefilled with extraction buffer.
stool specimen is needed for the extraction procedure.             Important: After extraction with BÜHLMANN Smart Prep
Stool specimens should be collected into plain tubes.              and ScheBo® Quick-PrepTM, centrifuge the tubes for 5
Important: The specimen must be collected without any              minutes at 3000 x g. Alternatively, transfer the homogenate
chemical or biological additions in the collection device.         into a 2 mL Eppendorf tube and centrifuge it in a
                                                                   microcentrifuge for 5 minutes at 3000 x g. Decant the
Specimen transport                                                 supernatant into a fresh, labeled tube and continue with the
Stool specimens should be received by the laboratory within        assay procedure.
3 days of collection. The specimens may be transported at
room temperature (23 °C).                                          WORKING RANGE
Specimen storage                                                   The assay can be performed according to the following
Received stool specimens should be stored at 2-8 °C and            procedures; lower or extended range ELISA procedure.
extracted within 3 days.                                           Which procedure is to be chosen depends on the expected
Extract storage                                                    calprotectin concentration of the samples. For samples up
Calprotectin in extracts obtained by the BÜHLMANN                  to 600 µg/g choose the lower range procedure (working
CALEX® Cap is stable at room temperature for 3 days, at 2-         range 10-600 µg/g). If the samples tend to exceed 600 µg/g
8 °C for 6 days and at -20 °C for 18 months.                       choose the extended range procedure (working range 30-
Calprotectin in extracts obtained by manual weighing               1800 µg/g).
method, by BÜHLMANN Smart-Prep or by ScheBo® Quick-
Prep™ is stable at 2-8 °C for 6 days or at -20 °C for 18
months.

STOOL SAMPLE EXTRACTION
Standard extraction procedure
1. Label and weigh (tare) the empty polypropylene tube
   together with the inoculation loop.
2. Take out 50 to 100 mg of the stool sample by means of
   the inoculation loop and place it into the pre-weighted
   tube.
3. Calculate the net amount of sample, break off the
   inoculation loop and leave the lower part of the loop in
   the tube.
4. Add extraction buffer according to the formula
   x mg stool x 49 = y µL extraction buffer (e.g. 50 mg stool
   + 2450 µL buffer) to the tube and close the tube.
5. Homogenize the sample on a multi tube vortexer by
   vigorous shaking (at highest speed) for 30 minutes.

Revision date:   2018-04-10                                 5/60                                         BÜHLMANN fCAL® ELISA
ASSAY PROCEDURE                                                    2. Prepare a plate with sufficient strips to test the required
                                                                      number of calibrators, controls and diluted samples.
Important: Allow the reagents to equilibrate to 18-28 °C              Remove excess strips from the holder and re-seal them
prior to use. Only dilute stool extracts. Standards and               in the foil pouch together with the desiccant packs
controls are ready to use.                                            without delay. Store refrigerated.
1.   Sample dilution option 1:                                     3. Wash the coated wells twice using at least 300 µL of
     Working range 10-600 µg/g                                        wash buffer per well. Empty the wells and tap the plate
1.1. Manual weighing procedure, Smart Prep, or ScheBo®                firmly onto blotting paper.
     Quick-PrepTM: Dilute the stool extracts 1:50 with
                                                                   Important: For every of the three wash steps a minimal
     incubation buffer (e.g. 20 µL extract and 980 µL
     incubation buffer) and mix well. Let the samples              incubation time of at least 20 seconds of the wash buffer in
     equilibrate for at least 5 minutes at 18-28 °C prior to       the wells must be ensured (see technical precautions –
     proceeding to step 4c.                                        ELISA procedure).

1.2. CALEX® Cap device: Dilute the stool extracts 1:5 with
     incubation buffer (e.g. 100 µL extract and 400 µL
     incubation buffer) and mix well. Let the samples
     equilibrate for at least 5 minutes at 18-28 °C prior to
     proceeding to step 4c.

                                                                   4a. Pipet 100 µL of incubation buffer (blank) and
                                                                      Pipet 100 µL of Calibrator A-E into the respective wells.
                                                                   4b. Pipet 100 µL of the controls low and high into the
                                                                       respective wells.
1.` Sample dilution option 2:
      Working range 30-1800 µg/g                                   4c. Pipet 100 µL of each diluted sample into the subsequent
The working range can be extended by a factor of 3, if you             wells.
dilute the samples 1:7500 instead of 1:2500. This procedure        5. Cover the plate with a plate sealer, and incubate for
is recommended, if high calprotectin concentrations are to            30 + max. 5 min on a plate rotator set at 450 rpm at
be expected. The precision, linearity and analytical                  18-28 °C (see Technical Precautions – ELISA
sensitivity of the extended range ELISA have been                     Procedure).
validated. The results of the validation (please refer to the
                                                                   6. Remove and discard the plate sealer. Empty the wells
performance characteristics section) support the extension
                                                                      and wash three times using at least 300 µL of wash
of the measuring range to 30-1800 µg/g.
                                                                      buffer per well (see Technical Precautions – ELISA
1.1` Manual weighing procedure, Smart Prep, or ScheBo®                Procedure). Empty the wells and tap the plate firmly onto
     Quick PrepTM: Dilute the stool extracts 1:150 with               blotting paper.
     incubation buffer (e.g. 20 µL extract and 2980 µL
     incubation buffer) and mix well. Let the samples
     equilibrate for at least 5 minutes at 18-28 °C prior to
     proceeding to step 4c.
1.2` CALEX® Cap device: Dilute the stool extracts 1:15 with
     incubation buffer (e.g. 50 µL extract and 700 µL
     incubation buffer) and mix well. Let the samples
     equilibrate for at least 5 minutes at 18-28 °C prior to
     proceeding to step 4c.

Revision date:   2018-04-10                                 6/60                                        BÜHLMANN fCAL® ELISA
7. Pipet 100 µL of enzyme label to each well.                         QUALITY CONTROL
8. Cover the plate with a plate sealer, and incubate for 30
                                                                      Thorough understanding of this instruction is necessary for
   ±5 min on a plate rotator set at 450 rpm at 18-28 °C.              the successful use of the product. Reliable results will be
9. Remove and discard the plate sealer. Empty the wells               obtained only by precise laboratory techniques (current
   and wash five times using at least 300 µL of wash buffer           GLP guidelines) and accurately following this instruction for
   per well. Empty the wells and tap the plate firmly onto            use.
   blotting paper.                                                    Since there is no control for calprotectin commercially
                                                                      available, we recommend using a pool of positive stool
                                                                      extracts for internal quality control.
                                                                      The reproducibility of standard curve parameters and
                                                                      control values should be within established limits of
                                                                      laboratory acceptability. The confidence limits for the
                                                                      controls are lot-specific and printed on the additional QC
                                                                      data sheet.
                                                                      If the performance of the assay does not meet the
                                                                      established limits and repetition has excluded errors in
                                                                      technique, check the following issues: i) pipetting,
Important: Allow the TMB substrate solution to equilibrate to         temperature controlling and timing ii) ELISA reader settings
18-28 °C.                                                             iii) expiration dates of reagents iv) storage and incubation
                                                                      conditions v) TMB substrate solution should be colorless vi)
10. Pipet 100 µL of the TMB substrate solution to all wells.
                                                                      purity of water.
11. Cover the plate with a plate sealer, protect the plate from
    direct light and incubate for 15 ±2 min on a plate rotator        STANDARDIZATION
    set at 450 rpm at 18-28 °C.
                                                                      The BÜHLMANN fCAL® ELISA calibrator values are
                                                                      assigned in multiple measurement runs using internal
                                                                      reference material based on human serum and the
                                                                      BÜHLMANN fCAL® ELISA measurement procedure. The
                                                                      calprotectin concentration of the internal reference material
                                                                      was established using purified MRP8/14 from human
                                                                      granulocytes as primary reference material.

                                                                      RESULTS AND CALCULATION
                                                                      Read the absorbance at 450 nm in a microplate reader for
12. Pipet 100 µL of stop solution to all wells. Remove air            each calibrator, control and sample using a 4 PL fit with
    bubbles with a pipette tip. Proceed to step 13 within 30          blank subtraction and have the concentration of the
    min.                                                              samples calculated.
13. Read the absorbance at 450 nm in a microtiter plate               Working range 10-600 µg/g
    reader.
                                                                      If you choose the lower range ELISA procedure, the
                                                                      calibrator concentrations have to be set as: 10, 30, 100, 300
                                                                      and 600 µg/g calprotectin. Additional dilution factors (if
                                                                      using a different final dilution than 1:2500) have to be
                                                                      multiplied with the results to obtain the final results.
                                                                      Refer to table 7 and figure 1 for typical data (results and
                                                                      standard curve). These results and standard curve are
                                                                      provided for demonstration purposes only. A standard curve
                                                                      must be generated for each set of samples to be assayed.
                                                                      Working range 30-1800 µg/g
                                                                      If you choose the extended range ELISA procedure, the
                                                                      following nominal calibrator values have to be set as: 30,
                                                                      90, 300, 900 and 1800 µg/g calprotectin. Additional dilution
                                                                      factors (if using a different final dilution than 1:7500) have to
                                                                      be multiplied with the results to obtain the final results.
                                                                      Refer to table 9 and figure 5 for typical data (results and
                                                                      standard curve). These results and standard curve are
                                                                      provided for demonstration purposes only. A standard curve
                                                                      must be generated for each set of samples to be assayed.

Revision date:   2018-04-10                                    7/60                                          BÜHLMANN fCAL® ELISA
LIMITATIONS                                                        The cut-off level suggested for adults (50 µg/g) can also be
                                                                   used for children aged from 4 to 17 years regardless of sex
• Reagents delivered with the BÜHLMANN fCAL® ELISA                 (ref. 8-9).
  kit are intended for the determination of calprotectin
  levels in human stool samples only.
                                                                   INTERPRETATION OF RESULTS
• Test results should be interpreted in conjunction with
  information available from clinical assessment of the            IBD MONITORING
  patient and other diagnostic procedures.                         The determination of fecal calprotectin is also a reliable and
• For IBD disease monitoring, multiple fecal calprotectin          simple way to assist the monitoring of IBD patients (ref. 10-
  measurements performed at up to 4 weeks intervals                20).
  have been suggested to have best diagnostic accuracy             Correlation of calprotectin levels and the inflammatory
  in predicting clinical relapse in patients (ref. 21-22).         status of patient’s intestinal mucosa, according to
• Patients who are taking NSAIDs regularly may have                endoscopic evaluations, were determined in three
  elevations in their fecal calprotectin levels.                   independent studies using BÜHLMANN calprotectin tests
                                                                   (table 5). The diagnostic value of calprotectin in predicting
INTERPRETATION OF RESULTS                                          clinical remission and relapse, according to patient`s
                                                                   symptoms, clinical activity indices, unplanned need for
DISTINGUISHING ORGANIC DISEASE FROM                                therapy escalation, hospitalization or emergency was
FUNCTIONAL GASTROINTESTINAL DISEASE                                determined in three studies using BÜHLMANN calprotectin
                                                                   tests (table 6).
Determination of fecal calprotectin is a reliable and easy
                                                                   Condensed knowledge of published cut-offs and the above
way to distinguish organic from functional gastrointestinal
                                                                   clinical performance studies support the following result
diseases (ref. 1-7).
                                                                   categories:
The following data were established with the BÜHLMANN
fCAL® ELISA (order code: EK-CAL). In a clinical study, fecal       Values below 100 µg/g:
calprotectin values of 344 symptomatic patients were               Fecal calprotectin levels below 100 µg/g can reliably
compared        with    endoscopic      findings.  Endoscopy       indicate patients, with low risk of clinical relapse, in
examination showed 264 patients with functional diseases           endoscopic remission for whom invasive endoscopic
whereas 80 patients had various organic diseases (colitis,         procedures can be avoided (ref. 10-20).
Crohn’s, ulcers, diverticulitis, polyps, adenomas, cancer, or
infectious diseases) (ref. 5).                                     Values between 100-300 µg/g:
ROC curve analysis (AUC: 0.962) resulted in an optimal             Fecal calprotectin levels between 100-300 µg/g may
clinical cut-off at 50 µg/g. Applying this cut-off, a clinical     indicate the necessity of tighter control in the following
sensitivity and specificity of 88.8 % and 93.6 %, respectively     period to assess disease development tendencies.
can be reached in the differentiation between organic and          Values above 300 µg/g:
functional diseases (refer to table 4).
                                                                   Fecal calprotectin levels above 300 µg/g should be
Fecal calprotectin levels from adults and children are
                                                                   repeated and, if raised levels are confirmed, prompt further
comparable, whereas levels of newborns can be
                                                                   investigative procedures (ref. 10-20).
significantly increased (ref. 8-9).
These data support the following recommendation for                The above result categories are recommendations. It is
interpretation of results:                                         advised that healthcare practitioners establish individual
                                                                   patient thresholds by determining the patient’s baseline
Values below 50 µg/g:
                                                                   calprotectin level during disease remission.
Calprotectin values below 50 µg/g are not indicative of
inflammation in the gastrointestinal tract. Patients with low      A false negative result that is a calprotectin result below
calprotectin levels are likely not to be in need of invasive       100 µg/g category that should show a value above
procedures to determine the inflammation cause (ref. 5).           300 µg/g, for a patient with endoscopic inflammation,
                                                                   although unlikely, may delay appropriate clinical decisions
Elevated values between 50 and 200 µg/g:                           and patient treatment. Therefore, it is important that the
Calprotectin values between 50 and 200 µg/g can represent          patient remains under the care of a healthcare practitioner
mild organic disease such as inflammation caused by                and reports any clinical symptoms.
NSAIDs, mild diverticulitis and IBD in remission phase. The        Studies have shown that high calprotectin levels, above
low inflammatory response shown within this range may              300 µg/g, will not always indicate development of a clinical
suggest repeating the measurement and performing further           relapse (ref. 10-20). High calprotectin levels should be
investigations.                                                    treated as a red flag signal and repeated. Confirmation of
Elevated values above 200 µg/g:                                    raised levels should prompt further investigative
                                                                   procedures.
Calprotectin values above 200 µg/g are indicative of active
organic disease with inflammation in the gastrointestinal
tract. Appropriate further investigative procedures by
specialists are suggested.

Revision date:   2018-04-10                                 8/60                                        BÜHLMANN fCAL® ELISA
PERFORMANCE CHARACTERISTICS                                       Inter-assay precision: 7.8-12.8 % CV
Working range: 10-600 µg/g                                        The inter-assay precision of the ELISA was calculated from
Repeatability: 1.8-5.9 % CV                                       five extracted stool samples. The aliquots were tested
Within-laboratory precision: 5.3 %-10.0 % CV                      according to the assay procedure in ten different runs by
                                                                  three technicians using two kit lots in two different labs. The
Repeatability and      within-laboratory precision   was          values are presented in table 11.
determined according to the CLSI approved guideline EP5-
A2. Nine extracted stool samples were tested in duplicate         Limit of Blank (LoB):
Menge
                          DEUTSCH                                           Reagenz                                         Code       Rekonstitution
                                                                                                EK-CAL        EK-CAL2
                                                                            Waschpufferk                                             Jede mit
ANWENDUNGSZWECK                                                             onzentrat 10x 1 Flasche           2 Flaschen             900 mL
                                                                                                                            B-CAL-WB
Der BÜHLMANN fCAL® ELISA ist ein in vitro Diagnosetest,                     Konservierungs x 100 mL           x 100 mL               deionisier-tem
                                                                            mittel                                                   H2O verdünnen
für die quantitative Bestimmung von Calprotectin in
humanen Stuhlproben und ist zur Unterstützung der                           Inkubations-
                                                                            puffer         2 Flaschen         3 Flaschen
Beurteilung einer Entzündung der Darmschleimhaut                                                                            B-CAL-IB   Gebrauchsfertig
                                                                            Konservierungs x 125 mL           x 125 mL
vorgesehen. Die Testergebnisse können zur Unterstützung                     mittel
dienen bei der Diagnose zur Unterscheidung einer
                                                                            Kalibratoren
organischen, entzündlichen Erkrankung des Magen-Darm-                       A-E1) 2)
Traktes (entzündliche Darmerkrankungen; z.B. Morbus                         Calprotectin in     5 Röhrchen    5 Röhrchen    B-CAL-
                                                                                                                                       Gebrauchsfertig
Crohn; oder Colitis ulcerosa) von einer funktionellen                       proteinhaltigem     x 1 mL        x 1 mL        CASET
Erkrankung (Reizdarmsyndrom) (Ref. 1-7) bei Patienten mit                   Puffer; Konser-
chronischen Bauchschmerzen, die älter als vier Jahre sind                   vierungsmittel

(Ref. 8-9). Die Testergebnisse können auch zur                              Kontrolle tief /
                                                                            hoch3)
Unterstützung bei der Überwachung entzündlicher
                                                                            Humanserum       2 Röhrchen       2 Röhrchen    B-CAL-
Darmerkrankungen (Ref. 10-20) verwendet werden.                                                                             CONSET
                                                                                                                                       Gebrauchsfertig
                                                                            mit              x 1 mL           x 1 mL
                                                                            Konservierungs
Nur für Laborzwecke.                                                        mittel
                                                                            Enzymmarker
PRINZIP DER METHODE                                                         anti-               1 Röhrchen    2 Röhrchen
                                                                            Calprotectin Ak                                 B-CAL-EL Gebrauchsfertig
Der BÜHLMANN fCAL® ELISA ermöglicht die selektive                                               x 12 mL       x 12 mL
                                                                            konjugiert mit
Messung von Calprotectin in Stuhlprobenextrakten mit dem                    HRP
Sandwich-ELISA. Die Mikrotiterplatte des BÜHLMANN                           TMB-Substrat
fCAL®     ELISAs     ist    mit     einem      monoklonalen                 Citrat-             1 Röhrchen    2 Röhrchen
                                                                                                                            B-TMB12    Gebrauchsfertig
Fängerantikörper beschichtet, der hochspezifisch für die                    gepufferte          x 12 mL       x 12 mL
                                                                            TMB-Lösung
heterodimeren und polymeren Calprotectinkomplexe ist.
Stuhlprobenextrakte von Patienten, Kontrollen zur                           Stopp-Lösung
                                                                                                1 Röhrchen    2 Röhrchen               Gebrauchsfertig
Bestimmung der ELISA Messakzeptanz und Kalibratoren                         0,25 M                                          B-STS12
                                                                                                x 12 mL       x 12 mL                  korrosiv
                                                                            Schwefelsäure
werden in die Wells der Mikrotiterplatte geladen. Nach einer
30-minütigen Inkubationszeit bei Raumtemperatur und nach                                                                                        Tabelle 1
den Waschschritten bindet ein Detektionsantikörper, der an                 1)
                                                                                Die tatsächliche Konzentrationen der Kalibratoren A-E betragen 4, 12,
Meerrettichperoxidase (HRP) gekoppelt ist, an die                               40, 120 und 240 ng/mL Calprotectin. Für die Extraktion und die
                                                                                Probenverdünnung wurde eine Gesamtverdünnung von 1:2500 bei den
Caplprotectinmoleküle,     die      wiederum      an     die
                                                                                Konzentrationen der Kalibratoren A-E bereits berücksichtigt. Für die
Fängerantikörper auf der Platte gebunden sind. Nach der                         „Lower Range“ ELISA Variante Im unteren Bereich müssen die
Inkubation und weiteren Waschschritten wird das                                 Kalibratorwerte wie folgt eingestellt werden: 10, 30, 100, 300 und
chromogene HRP-Substrat und Tetramethylbenzidin (TMB)                           600 µg/g Calprotectin.
                                                                           2)
                                                                                Wenn Sie die „Extended Range“ ELISA Variante verwenden, müssen die
hinzugefügt (Bildung einer blauen Farbe); danach wird die
                                                                                nominalen Kalibratorwerte wie folgt eingestellt werden: 30, 90, 300, 900
Reaktion gestoppt (Farbumschlag nach gelb). Die                                 und 1800 µg/g Calprotectin.
Absorption wird bei 450 nm gemessen. Die endgültige                        3)
                                                                                Die Kontrollen enthalten Lot-abhängige Konzentrationen von nativem,
Calprotectinkonzentration    in    µg/g    Stuhl   in   den                     humanem Calprotectin. Die genauen Konzentrationen werden auf dem
                                                                                QC Datenblatt angegeben.
Patientenproben wird mithilfe der Kalibrierkurve ermittelt,
die anhand der gemessenen Kalibratorwerte erstellt worden
ist.

GELIEFERTE REAGENZIEN UND VORBEREITUNG
                 Menge
Reagenz                                     Code      Rekonstitution
                 EK-CAL        EK-CAL2
Extraktions-     3 Flaschen    6 Flaschen
                                            B-CAL-EX Gebrauchsfertig
puffer           x 125 mL      x 125 mL
Mikrotiter-
platte
                             2 x 12 x 8
Beschichtet mit 12 x 8 Wells Wells          B-CAL-MP Gebrauchsfertig
anti-Calprotectin
mAk
Abdeckfolien     3 Sück        6 Stück          -     Gebrauchsfertig

Revision date:    2018-04-10                                       10/60                                                   BÜHLMANN fCAL®ELISA
LAGERUNG UND HALTBARKEIT DER REAGENZIEN                                        ELISA
Ungeöffnete Reagenzien                                                         • Präzisionspipetten mit Einwegspitzen für 10, 100 und
                                                                                 1000 µL
Bei 2-8 °C lagern. Zu verwenden bis zum Verfallsdatum, angegeben auf
der Packungsetikette.                                                          • Polystyrol oder Polypropylen Einwegröhrchen            zur
Geöffnete / rekonstituierte Reagenzien                                           Durchführung von Probenverdünnungen
Extraktionspuffer   Bis zum Verfallsdatum bei 2-8 °C lagern.                   • 1000 mL    Messkolben         zur     Verdünnung      des
                    Ungebrauchte Streifen sofort in die mit                      Waschpufferkonzentrats
Mikrotiterplatte
                    Trockenmittel versetzte Packung zurücklegen.               • Mikrotiterplattenwaschautomat oder Spritzflasche für
                    Packung gut verschliessen. Bei 2-8°C bis zum
                    Verfallsdatum haltbar.                                       Waschpuffer (siehe technische Vorsichtsmassnahmen)
                    Bei 2-8 °C bis 6 Monate nach der Verdünnung                • Mikrotiterplattenschüttler (siehe technische Vorsichts-
Waschpuffer
                    lagern.                                                      massnahmen)
Inkubationspuffer                                                              • Saugfähiges Papier
Kalibratoren                                                                   • Mikrotiterplattenphotometer    mit      optischem    Filter
Kontrollen                                                                       (450 nm)
                    Bis zum Verfallsdatum bei 2-8 °C lagern.
Enzymmarker
TMB-Substrat                                                                   VORSICHTSMASSNAHMEN
Stopp-Lösung                                                                   Sicherheitsmassnahmen
                                                               Tabelle 2       • Die Kalibratoren und Kontrollen enthalten Bestandteile
                                                                                  humanen Ursprungs. Obwohl sie negativ in Tests für
REAGENZIEN UND MATERIAL ZUSÄTZLICH                                                HBV Oberflächenantigen, HCV und HIV1/2 Antikörper
ERHÄLTLICH                                                                        waren, sollten sie gemäss „guter Laborpraxis“ (GLP) als
                                                                                  potentiell infektiös behandelt werden und die
Extraktionsprodukte für Stuhlproben                                               entsprechenden Sicherheits-vorkehrungen getroffen
Extraktionsprodukte zur Stuhlextraktion werden nicht mit                          werden.
diesem Kit mitgeliefert. Eines der in Tabelle 3 beschrieben                    • Stopp-Lösung: Die Stopp-Lösung (B-STS12) enthält
Produkte muss zusätzlich zum Kit bestellt werden.                                 Schwefelsäure (0,25 M). Das Reagenz reizt die Augen,
                                                                                  Haut und Schleimhäute. Kontakt mit Augen, Haut und
 Extraktionsprodukte     Menge                       Code
                                                                                  Kleidung vermeiden. Bei Berührung mit den Augen oder
                         Packungen zu 50, 200                                     der Haut sofort mit viel Wasser abwaschen.
                         und 500 Röhrchen,           B-CALEX-C50
 CALEX® Cap              gefüllt mit                 B-CALEX-C200              • Reagenzien: Kontakt der Reagenzien mit der Haut, den
                         Extraktionspuffer,          B-CALEX-C500                Augen oder den Schleimhäuten vermeiden. Im Falle
                         5 mL / gebrauchsfertig
                                                                                 eines Kontaktes sofort mit reichlich Wasser spühlen,
 Smart-Prep
                         50 Röhrchen, Spatel und
                                                     B-CAL-RD                    ansonsten kann eine Reizung oder Verätzungen
                         Böden                                                   auftreten.
                         50 Röhrchen bestehend                                 • Ungebrauchte Lösungen sollten gemäss den lokalen
 ScheBo® Quick-          aus Röhrchen, Konus                                     gesetzlichen Bestimmungen entsorgt werden.
                                                     B-CAL-SO50
 PrepTM                  und Dosierspitze,
                         1,3 mL / gebrauchsfertig                              Technische Vorsichtsmassnahmen
                                                               Tabelle 3       Kit Komponenten
                                                                               • Auf Grund des Produktionsprozesses kann es
ERFORDERLICHE NICHT IM LIEFERUMFANG                                               Rückstände in den Wells der Mikrotiterplatten geben.
ENTHALTENE MATERIALIEN                                                            Sie werden mit dem 1. Waschen (Testdurchführung
Extraktion                                                                        Schritt 3) entfernt und haben keinen Einfluss auf die
                                                                                  Ergebnisse.
• 10 µL Einwegimpfschlingen
                                                                               • Lesen Sie vor der Testdurchführung die Arbeitsanleitung
• 15 mL Polypropylen Einwegröhrchen mit Schraubver-
                                                                                 sorgfältig durch. Die Testqualität kann negativ
  schluss für die Standardextraktion
                                                                                 beeinflusst werden, wenn die Reagenzien nicht korrekt
• Laminar Flow Arbeitsplatz                                                      verdünnt oder verändert werden, sowie nicht
• „Multi Tube“ Vortex Mixer                                                      entsprechend der in dieser Anleitung angegebenen
• Präzisionswaage (10-150 mg)                                                    Lagerungsbedingungen gelagert werden.

• Mikrozentrifuge (≥3000 x g)                                                  • Die Reagenzien dürfen nach Ablauf des Verfallsdatums
                                                                                 nicht mehr verwendet werden.
• Zentrifuge (≥500 x g)
                                                                               • Mischen Sie nicht Reagenzien verschiedener Lots.
                                                                               • Vermeiden Sie unter allen Umständen, dass es zu
                                                                                 Kontaminationen zwischen verschiedenen Reagenzien,
                                                                                 Proben und zwischen den Wells kommt.

Revision date:      2018-04-10                                         11/60                                         BÜHLMANN fCAL® ELISA
• Die Reagenzien vor Gebrauch auf Raumtemperatur                  PROBENGEWINNUNG UND LAGERUNG
  äquilibrieren lassen und mischen (vortexen).
                                                                  Wenn Extraktionsröhrchen für die Extraktion verwendet
• Mikrotiterstreifen dürfen nicht wiederverwendet werden.         werden, werden weniger als 1 g native Stuhlprobe benötigt.
Extraktion                                                        Die Stuhlprobe muss in einem leeren Entnahmeröhrchen
• Um verlässliche, quantitative Resultate zu erhalten, ist        gesammelt werden.
  es wichtig, dass die im Extraktionsröhrchen enthaltene          Wichtig: Die Stuhlproben dürfen nicht mit Röhrchen, die
  Stuhlprobe      vollständig    homogenisiert      wird.         chemische oder biologische Zusätze enthalten, gesammelt
  Kontaminationen am oberen Rand des Extraktions-                 werden.
  röhrchens sollten vermieden werden. Unlösliche
                                                                  Transport der Proben
  (unverdaute) Bestandteile können auch nach der
  Extraktion verhanden sein.                                      Innerhalb von 3 Tagen nach Gewinnung des
                                                                  Untersuchungsmaterials sollte es vom Labor erhalten
ELISA Prozedur                                                    werden. Die Proben können bei Raumtemperatur
• Die korrekte Durchführung der in der Arbeitsvorschrift          transportiert werden (23 °C).
   beschriebenen Waschschritte ist essentiell, um
                                                                  Lagerung der Proben
   reproduzierbare Resultate zu garantieren. Eine minimale
   Inkubationszeit des Waschpuffers im Well von                   Erhaltene Stuhlproben sollten bei 2-8 °C gelagert und
   mindestens 20 Sekunden muss bei jedem Waschschritt             innerhalb von 3 Tagen extrahiert werden.
   eingehalten werden.                                            Lagerung des Extraktes
• Wird ein Waschautomat eingesetzt, muss der „Platten-            Calprotectin in Extrakten, die mit BÜHLMANN CALEX® Cap
  Modus“ gewählt werden. Das heisst, dass jeder Schritt           gewonnen wurden, sind bei Raumtemperatur 3 Tage, bei 2-
  (Einfüllen) erst über die gesamte Platte ausgeführt wird,       8 °C 6 Tage und bei -20 °C 18 Monate stabil.
  bevor der nächste Schritt (Absaugen) gestartet wird.            Calprotectin     in   Extrakten,     die mit  manuellen
  Somit kann die minimale Inkubationszeit gewährleistet           Wiegemethoden, wie BÜHLMANN Smart-Prep oder
  werden.                                                         ScheBo® Quick-Prep™, gewonnen wurden, ist bei 2-8 °C 6
• Die angegebene Anzahl von Waschschritten muss                   Tage oder bei -20 °C 18 Monate stabil.
  eingehalten werden, um reproduzierbare Resultate zu
  gewährleisten.                                                  STUHLPROBENEXTRAKTION
• Der Mikrotiterplattenschüttler muss auf 450 rpm                 Standardextraktionsanleitung
  (
Extraktion unter Verwendung von                                    1.2 CALEX® Cap: Die Stuhlextrakte mit Inkubationspuffer
Stuhlextraktionsröhrchen                                               1:5 verdünnen (z.B. 100 µL Extrakt + 400 µL
                                                                       Inkubationspuffer). Nach der Verdünnung gut mischen
Die Extraktion ist in den Extraktionsröhrchen beiliegenden
                                                                       und die Proben vor Gebrauch in Schritt 4c mindestens
Anleitungen beschrieben und illustriert.
                                                                       5 Minuten bei 18-28 °C stehen lassen.
1. CALEX® Cap (Code: B-CALEX-C50 / B-CALEX-C200 /
   B-CALEX-C500): Die Extraktionsröhrchen sind mit 5 mL
   Extraktionspuffer gefüllt.
Wichtig: Nach der Extraktion werden die Extraktions-
röhrchen 5 Minuten bei 500-3000 x g zentrifugiert. Danach
mit der Testdurchführung fortfahren.
2. Fäkales    Extraktionsbesteck Roche      (Code:
   10745804322) oder BÜHLMANN Smart-Prep (Code: B-
   CAL-RD).
3. ScheBo® Quick-Prep™ (Code B-CAL-SO50): Die
   Extraktionsröhrchen sind vorgefüllt mit Extraktionspuffer.
Wichtig: Nach der Extraktion mit Smart-Prep oder ScheBo®           1.` Option 2 für die Probenverdünnung:
Quick-Prep™ werden die Röhrchen 5 Minuten bei 3000 x g                  Messbereich 30–1800 µg/g
zentrifugiert. Alternativ wird das Homogenat in ein 2 mL           Der Messbereich kann um einen Faktor von 3 erweitert
Eppendorf Röhrchen überführt und 5 Minuten bei 3000 x g            werden, wenn die Proben 1:7500 statt 1:2500 verdünnt
in einer Mikrofuge zentrifugiert. Den Überstand in ein             werden. Diese Testversion wird empfohlen, wenn hohe
frisches beschriftetes Röhrchen überführen und mit der             Calprotectinkonzentrationen zu erwarten sind. Die
Testdurchführung fortfahren.                                       Präzision, Linearität und analytische Empfindlichkeit des
                                                                   „Extended Range“ ELISAs wurde validiert. Die Ergebnisse
MESSBEREICHE                                                       der Validierung (Siehe Abschnitt „Leistunbsmerkmale“)
                                                                   unterstützen die Erweiterung des Messbereichs auf 30-
Der Test kann entweder nach der Anleitung für den unteren
                                                                   1800 µg/g.
Konzentrationsbereich „Lower Range“ ELISA Variante oder
der Anleitung für den erweiterten Messbereich „Extended            1.1` Manuelle Einwaage, Smart Prep oder ScheBo® Quick
Range“ ELISA Variante durchgeführt werden. Welche                       Prep™: Die Stuhlextrakte mit Inkubationspuffer 1:150
Version Sie wählen sollten, hängt von der erwarteten                    verdünnen (z.B. 20 µL Extrakt + 2980 µL Inkubations-
Calprotectinkonzentration der Proben ab. Für Proben bis zu              puffer). Nach der Verdünnung gut mischen und die
600 µg/g sollte die Anleitung für den Messbereich 10-                   Proben vor Gebrauch in Schritt 4c für mindestens 5
600 µg/g verwendet werden. Wenn die Konzentration der                   Minuten bei 18-28 °C stehen lassen.
Proben jedoch häufig oberhalb von 600 µg/g liegt, raten wir        1.2` CALEX® Cap: Die Stuhlextrakte mit Inkubationspuffer
zu der Anleitung für den erweiterten Messbereich 30-                    1:15 (z.B. 50 µL Extrakt + 700 µL Inkubationspuffer).
1800 µg/g.                                                              Nach der Verdünnung gut mischen und die Proben vor
                                                                        Gebrauch in Schritt 4c für mindestens 5 Minuten bei
TESTDURCHFÜHRUNG                                                        18-28 °C stehen lassen.
Wichtig: Die Reagenzien sollten vor der Verwendung auf
eine Temperatur von 18-28 °C äquilibriert werden.
Nur die Stuhlextrakte verdünnen. Kalibratoren und
Kontrollen sind gebrauchsfertig.
1.  Option 1 für die Probenverdünnung:
    Messbereich 10-600 µg/g
1.1 Manuelle Einwaage, Smart Prep oder ScheBo® Quick
    Prep™: Die Stuhlextrakte mit Inkubationspuffer 1:50
    verdünnen (z.B. 20 µL Extrakt + 980 µL Inkubations-
    puffer). Nach der Verdünnung gut mischen und, vor
    Gebrauch in Schritt 4c, die Proben für mindestens 5
    Minuten bei 18-28 °C stehen lassen.
                                                                   2. Eine Mikrotiterplatte mit ausreichender Menge an
                                                                      Streifen für die Bestimmung von Kalibratoren, Kontrollen
                                                                      und verdünnten Proben bestücken. Ungebrauchte
                                                                      Streifen vom Halter entfernen und unverzüglich mit
                                                                      Trockenmittel einpacken und gekühlt lagern.

Revision date:   2018-04-10                                13/60                                       BÜHLMANN fCAL® ELISA
3. Wells zweimal mit jeweils ≥300 µL Waschpuffer                7. 100 µL Enzymmarker zu allen Wells zugeben.
   waschen. Waschpuffer ausschütten und Platte sorgfältig       8. Mikrotiterplatte mit einer Folie abdecken und auf einem
   auf saugfähigem Papier ausklopfen.                              Mikrotiterplattenschüttler bei 450 rpm 30 ±5 Min. bei 18-
Wichtig: Eine minimale Inkubationszeit des Waschpuffers            28 °C inkubieren.
im Well von 20 Sekunden muss bei allen drei                     9. Abdeckfolie entsorgen, die Wells entleeren und 5 x mit
Waschschritten eingehalten werden (siehe technische                jeweils mindestens 300 µL Waschpuffer waschen.
Vorsichtsmassnahmen - ELISA).                                      Waschpuffer ausschütten und Platte sorgfältig auf
                                                                   saugfähigem Papier ausklopfen.

                                                                Wichtig: TMB-Substrat vor dem Gebrauch auf 18-28° C
                                                                äquilibrieren lassen.
4a. 100 µL Inkubationspuffer (Blank) in das entsprechende
    Well pipettieren.                                           10. 100 µL TMB-Substrat zu jedem Well zugeben.
   Je 100 µL Kalibrator A-E in das entsprechende Well           11. Mikrotiterplatte zudecken und 15 ±2 Min. bei 18-28 °C
   pipettieren.                                                     auf einem Mikrotiterplattenschüttler bei 450 rpm
                                                                    inkubieren. Platte vor direktem Licht schützen.
4b. Je 100 µL Kontrolle tief und hoch in das entsprechende
    Well pipettieren.
4c. Je 100 µL der verdünnten Proben in die nächsten Wells
    pipettieren.
5. Mikrotiterplatte mit einer Folie abdecken und auf einem
   Mikrotiterplattenschüttler bei 450 rpm 30 + max. 5
   Minuten bei 18-28 °C inkubieren (siehe technische
   Vorsichtsmassnahmen - ELISA).
6. Abdeckfolie entfernen, die Wells entleeren und 3 x mit
   jeweils mind. 300 µL Waschpuffer waschen (siehe
   technische     Vorsichtsmassnahmen        -   ELISA).        12. 100 µL Stopp-Lösung zu jedem Well zugeben und
   Waschpuffer ausschütten und Platte sorgfältig auf                vorhandene Luftbläschen mit Pipettenspitzen entfernen.
   saugfähigem Papier ausklopfen.                                   Innerhalb der nächsten 30 Minuten mit Schritt 13
                                                                    fortfahren.
                                                                13. Optische Dichte in einem Mikrotiterplattenphotometer
                                                                    bei 450 nm messen.

Revision date:   2018-04-10                             14/60                                       BÜHLMANN fCAL® ELISA
In Tabelle 9 und Abbildung 5 sind Beispiele für Ergebnisse
QUALITÄTSKONTROLLE
                                                                   und die Standardkurve angegeben. Diese Ergebnisse und
Ein vollständiges Verständnis dieser Anleitung ist für den         die Standardkurve sind nur als Beispiel gedacht. Sie
erfolgreichen    Einsatz    des     Produktes      notwendig.      müssen für jeden Ansatz eine Standardkurve ansetzen.
Zuverlässige Resultate werden nur durch die Anwendung
von GLP (aktuelle GLP Richtlinien) und die Einhaltung der          LEISTUNGSEINSCHRÄNKUNGEN
Anleitung erreicht.                                                • Die mit dem BÜHLMANN fCAL® ELISA Kit
Da es keine kommerziell erhältlichen Kontrollen für                  bereitgestellten Reagenzien sind nur für die Bestimmung
Calprotectin gibt, wird empfohlen, einen Pool von positiven          der     Calprotectinkonzentrationen      in    humanen
Stuhlextrakten als interne Qualitätskontrolle mitzuführen.           Stuhlproben vorgesehen.
Alle Kontrollen müssen im angegebenen Vertrauensbereich
                                                                   • Testergebnisse sollten in Verbindung mit in einer
liegen. Die Vertrauensbereiche der Kontrollen sind Lot-
                                                                     klinischen Beurteilung des Patienten gewonnenen
spezifisch und sind auf dem Kit beiliegenden QC Datenblatt
                                                                     Informationen     und   sonstigen     Diagnoseverfahren
angegeben.
                                                                     ausgewertet werden.
Falls die Ergebnisse des Testes nicht innerhalb der
erwarteten Bereiche liegen und wiederholte Messungen               • Um bei der IBD-Überwachung die beste diagnostische
einen Durchführungsfehler ausschliessen, sind folgende               Genauigkeit zu erreichen, einen klinischen Rückfall
Punkte zu überprüfen: i) Pipetten, Temperatur und                    vorherzusehen, wurde empfohlen, mehrere Messungen
Zeitmessung, ii) Photometer Eichung, iii) Verfallsdaten der          des fäkalen Calprotectins in bis zu 4 Wochen Intervallen
Reagenzien, iv) Lagerung- und Inkubationsbedingungen, v)             durchzuführen (Ref. 21-22).
das TMB-Substrat sollte farblos sein, vi) Wasserreinheit.          • Patienten, die regelmäßig NSAIDs einnehmen, haben
                                                                     möglicherweise erhöhte Calprotectinkonzentrationen im
STANDARDISIERUNG                                                     Stuhl.
Die BÜHLMANN fCAL® ELISA Kalibratorwerte werden in
mehrfachen Messdurchgängen mithilfe von internem                   INTERPRETATION DER ERGEBNISSE
Referenzmaterial zugewiesen, das auf Humanserum und                UNTERSCHEIDEN EINER ORGANISCHEN
dem BÜHLMANN fCAL® ELISA Messverfahren basiert. Die                ERKRANKUNG VON EINER FUNKTIONELLEN
Calprotectinkonzentration des internen Referenzmaterials
                                                                   GASTROINTESTINALEN ERKRANKUNG
wurde mithilfe von gereinigtem MRP8/14 aus humanen
Granulozyten als primäres Referenzmaterial ermittelt.              Die Bestimmung des Calprotectinspiegels in Stuhlproben
                                                                   kann als zuverlässige und einfache Hilfe bei der
ERGEBNISSE UND BERECHNUNGEN                                        Unterscheidung zwischen organischen und funktionellen
Messen Sie die Extinktion bei 450 nm in einem                      gastrointestinalen Erkrankungen verwendet werden (Ref. 1-
Mikrotiterplattenphotometer für Kalibratoren, Kontrollen und       7).
Proben unter Verwendung eines 4PL Auswertemodus und                Die folgenden Daten wurden mit dem BÜHLMANN fCAL®
Leerwert- (Blank) abzug.                                           ELISA erhoben (Bestellcode: EK-CAL). In einer klinischen
                                                                   Studie     wurden    die     Calprotectinwerte   von    344
Messbereich 10-600 µg/g                                            symptomatischen Patienten mit den Ergebnissen einer
Wenn Sie die “Lower Range“ ELISA Variante verwenden,               endoskopischen Untersuchung verglichen.
müssen die Kalibratorkonzentrationen wie folgt eingestellt         Die endoskopische Untersuchung zeigte bei 264 Patienten
werden: 10, 30, 100, 300 und 600 µg/g Calprotectin.                eine funktionelle Erkrankung, während bei 80 Patienten
Zusätzliche Verdünnungsfaktoren (bei Verwendung einer              unterschiedliche organische Erkrankungen festgestellt
anderen Verdünnung als 1:2500) müssen für den Erhalt der           wurden (Kolitis, Crohn’s, Ulzera, Divertikulitis, Polypen,
endgültigen Ergebnisse mit den Ergebnissen multipliziert           Adenome, Karzinome oder Infektionserkrankungen) (Ref.
werden.                                                            5).
In der Tabelle 7 und Abbildung 1 werden Beispiele für              Die ROC Analyse (AUC: 0,962) ergab einen optimalen
Ergebnisse und die Standardkurve gezeigt. Diese                    klinischen Grenzwert von 50 μg/g für die Differenzierung
Ergebnisse und die Standardkurve sind nur als Beispiel             zwischen organischen und funktionellen Erkrankungen mit
gedacht. Sie müssen für jeden Ansatz eine Standardkurve            einer klinischen Spezifität von 88,8 % und einer Sensitivität
ansetzen.                                                          von 93,6 % (Tabelle 4).
                                                                   Calprotectinwerte von Erwachsenen und Kindern zwischen
Messbereich 30-1800 µg/g                                           4 und 17 Jahren sind vergleichbar, während die Werte von
Wenn Sie die „Extended Range“ ELISA Variante                       Neugeborenen signifikant höher sind (Ref. 8).
verwenden,      müssen      die   folgenden    nominalen           Diese Daten stützen die folgenden Empfehlungen zur
Kalibratorwerte eingestellt werden: 30, 90, 300, 900 und           Beurteilung der Ergebnisse:
1800 µg/g Calprotectin. Zusätzliche Verdünnungsfaktoren
(bei Verwendung einer anderen Verdünnung als 1:7500)
müssen für den Erhalt der endgültigen Ergebnisse mit den
Ergebnissen multipliziert werden.

Revision date:   2018-04-10                                15/60                                        BÜHLMANN fCAL® ELISA
Werte oberhalb von 300 µg/g:
Werte unter 50 µg/g:
                                                                Messungen von fäkalen Calprotectinkonzentrationen
Calprotectinwerte unter 50 µg/g schliessen eine Ent-
                                                                oberhalb von 300 µg/g sollten wiederholt werden. Falls die
zündung des gastrointestinalen Traktes weitgehend aus.
                                                                erhöhten Werte bestätigt werden, sollten unverzüglich
Patienten mit niedrigen Calprotectinkonzentrationen
                                                                weitere Untersuchungen erfolgen (Ref. 10-20).
benötigen vermutlich keine invasiven Untersuchungen, um
die Entzündungsursache zu bestimmen (Ref. 4).                   Die oben genannten Ergebniskategorien sind als
                                                                Empfehlungen zu betrachten. Es wird empfohlen, dass
Erhöhte Werte zwischen 50 und 200 µg/g:
                                                                Ärzte die Grenzwerte für den einzelnen Patienten festlegen,
Calprotectinwerte zwischen 50 und 200 µg/g können durch         indem Sie den Ausgangswert für Calprotectin während der
eine milde Form der organischen Erkrankung wie z.B. eine        Remission bestimmen. Ein falsch-negatives Resultat bei
durch NSAIDs verursachte Entzündung, eine milde Form            einen Patienten mit einer endoskopisch nachweisbaren
der Divertikulitis und durch IBD in einer Remissionsphase       Entzündung, das ein Calprotectinergebnis in der Kategorie
verursacht werden. Da eine geringe Entzündungsaktivität         mit Werten unter 100 µg/g anzeigt, aber einen Wert
vorhanden ist, empfehlen sich eine Wiederholungs-               oberhalb von 300 µg/g zeigen sollte, kann - obwohl
messung und weitere Untersuchungen.                             unwahrscheinlich - geeignete klinische Entscheidungen und
Erhöhte Werte oberhalb von 200 µg/g:                            die Behandlung des Patienten verzögern. Daher ist es
Calprotectinwerte oberhalb von 200 µg/g deuten auf eine         wichtig, dass der Patient weiterhin von einem Arzt betreut
aktive Form einer organischen Erkrankung des gastro-            wird und mögliche klinische Symptome meldet. Studien
intestinalen Traktes hin. Es werden entsprechende weitere       haben gezeigt, dass hohe Calprotectinwerte, oberhalb von
Untersuchungen durch Spezialisten empfohlen.                    300 µg/g, nicht immer auf die Entwicklung eines klinischen
                                                                Rückfalls hindeuten (Ref. 10-20). Hohe Calprotectinwerte
Der für Erwachsene empfohlene Cut-off Wert von 50 µg/g          müssen als Warnsignal betrachtet und die Messung muss
kann auch für Kinder zwischen 4 und 17 Jahren verwendet         wiederholt werden. Bei einer Bestätigung erhöhter Werte
werden, unabhängig von deren Geschlecht (Ref. 8-9).             sind unverzüglich weitere Untersuchungen vorzunehmen.

INTERPRETATION DER ERGEBNISSE                                   LEISTUNGSMERKMALE

IBD-ÜBERWACHUNG                                                 Messbereich: 10-600 µg/g
                                                                Recovery: 1,8-5,9 % CV
Die Bestimmung von fäkalem Calprotectin ist auch eine
                                                                Intra-Assay Präzision: 5,3 %-10,0 % CV
zuverlässige und einfache Methode, um die Überwachung
von IBD-Patienten zu unterstützen (Ref. 10-20).                 Wiederholbarkeit und Intra-Assay Präzision wurden gemäß
Die Korrelation der Calprotectinkonzentrationen und dem         der CLSI Richtlinie EP5-A2 bestimmt. Neun extrahierte
Entzündungsstatus der Darmschleimhaut von Patienten mit         Stuhlproben wurden entsprechend der Arbeitsanleitung
endoskopischen Bewertungen wurde in drei voneinander            über einen Zeitraum von 20 Tagen in Duplikaten geprüft.
unabhängigen Studien mit den BÜHLMANN Calprotectin-             Pro Tag wurde ein Testlauf durchgeführt. Die Werte sind in
tests (Tabelle 5) ermittelt.                                    Tabelle 8 dargestellt.
Der diagnostische Wert von Calprotectin zur Vorhersage          Limit of Blank (LoB):
Funktionelle Empfindlichkeit:
Quantité
                                                                               Réactifs                                         Code        Reconstitution
                            FRANCAIS                                                                EK-CAL        EK-CAL2
                                                                               Tampon
UTILISATION PREVUE                                                             d’incubation         2 flacons     3 flacons de
                                                                                                                               B-CAL-IB     Prêt à l’emploi
                                                                               Avec                 de125 mL      125 mL
Le test BÜHLMANN        fCAL®  ELISA est un test diagnostique                  conservateurs
in vitro de dosage quantitatif de la calprotectine dans les                    Calibrateurs A-
échantillons de selles humaines. Son but est d'aider à                         E1) 2)
                                                                               Calprotectine        5 flacons de 5 flacons de B-CAL-
évaluer l'état inflammatoire de la muqueuse intestinale. Les                                        1 mL         1 mL         CASET
                                                                                                                                            Prêts à l’emploi
                                                                               dans un tampon
résultats de l'essai peuvent contribuer, d'une part, au                        protéique avec
diagnostic permettant de distinguer – chez les patients de                     conservateurs
plus de quatre ans souffrant de douleurs abdominales                           Contrôles bas
chroniques (réf. 8-9) – une maladie inflammatoire du tractus                   et élevé3)
                                                                                                    2 flacons     2 flacons de B-CAL-
gastro-intestinal de type organique (maladie inflammatoire                     Sérum humain                                                 Prêts à l’emploi
                                                                                                    de1 mL        1 mL         CONSET
                                                                               avec
chronique de l’intestin MICI, par ex. maladie de Crohn ou                      conservateurs
recto-colite     hémorragique,     RCH)       d'une    maladie                 Marqueur
fonctionnelle (syndrome de l’intestin irritable, SII) (réf. 1-7)               enzymatique
et, d'autre part, au suivi d’une MICI (réf. 10-20).                            Ac anti-             1 flacon      2 flacons de
                                                                                                                               B-CAL-EL Prêt à l’emploi
                                                                               calprotectine        de12 mL       12 mL
                                                                               conjugué à la
Pour utilisation en laboratoire uniquement.                                    HRP
                                                                               Substrat TMB
PRINCIPE DU TEST                                                               Solution de          1 flacon      2 flacons de
                                                                                                                               B-TMB12      Prêt à l’emploi
                                                                               TMB dans un          de12 mL       12 mL
La trousse BÜHLMANN            fCAL®
                                  ELISA permet de mesurer                      tampon citrate
de façon sélective la calprotectine dans des extraits fécaux                   Solution stop        1 flacon      2 flacons de              Prête à l’emploi
au moyen d'un dosage ELISA de type sandwich. La                                                                                B-STS12
                                                                               0.25 M H2SO4         de12 mL       12 mL                     corrosif
microplaque du test BÜHLMANN fCAL® ELISA est                                                                                                        Tableau 1
recouverte à l'aide d'un anticorps de capture monoclonal                      1)
                                                                                   Les concentrations actuelles de calprotectine des calibrateurs A à E sont
(Acm) hautement spécifique vis-à-vis des complexes                                 respectivement : 4, 12, 40, 120 et 240 ng/mL. Après extraction et dilution
hétérodimères et polymères de calprotectine. On dépose                             de l’échantillon, une dilution à 1:2500 est prise en compte pour la
sur les puits de la microplaque les extraits d'échantillons                        détermination des calibrateurs A à E. Dans le cas de la procédure ELISA
fécaux du patient, les témoins permettant de déterminer                            sur la gamme la plus basse, les valeurs des calibrateurs doivent être les
                                                                                   suivantes : 10, 30, 100, 300 et 600 µg/g de calprotectine.
l'acceptabilité du dosage ELISA ainsi que des calibrateurs.                   2)
                                                                                   Si l’utilisateur choisit la procédure ELISA sur la gamme étendue, les
À l'issue d'une incubation de 30 minutes à température                             valeurs nominales des calibrateurs doivent être les suivantes : 30, 90,
ambiante et d'étapes de lavage, un anticorps (Ac) de                               300, 900 et 1 800 µg/g de calprotectine.
                                                                              3)
détection conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) met en                         Les concentrations en calprotectine humaine native des contrôles varient
                                                                                   en fonction des lots. Veuillez-vous référer à la fiche de contrôle qualité
évidence les molécules de calprotectine liées à l'anticorps                        pour les concentrations effectives.
de capture sur la microplaque. Après l'incubation et d'autres
étapes de lavage, on ajoute le substrat chromogène de la
                                                                              STOCKAGE ET DUREE DE CONSERVATION
HRP, la tétraméthylbenzidine (TMB) (formation d'une
                                                                              DES REACTIFS
coloration bleue) puis une solution qui arrête la réaction (la
coloration vire au jaune). On mesure l'absorption à 450 nm.                   Réactifs non ouverts/ non entamés
À partir de la courbe d’étalonnage établie avec les valeurs                   Stables à 2-8 °C. Ne pas utiliser au-delà de la date de péremption
de mesure des calibrateurs, on détermine la concentration                     figurant sur les étiquettes.
finale de calprotectine, en µg/g de selles, dans les                          Réactifs ouverts/ reconstitués
échantillons du patient.                                                      Tampon d’extraction       Stables à 2-8 °C jusqu’à la date de péremption
                                                                                                        Replacer immédiatement les barrettes non
REACTIFS FOURNIS ET PREPARATION                                                                         utilisées dans la pochette contenant le
                                                                              Microplaque
                                                                                                        dessiccateur puis la refermer soigneusement.
                 Quantité                                                                               Stable à 2-8 °C jusqu’à la date de péremption.
Réactifs                                    Code      Reconstitution
                 EK-CAL        EK-CAL2                                        Tampon de lavage          Stable à 2-8 °C pendant 6 mois après dilution
Tampon           3 flacons de 6 flacons de                                    Tampon d’incubation
                                           B-CAL-EX Prêt à l’emploi
d’extraction     125 mL       125 mL
                                                                              Calibrateurs
Microplaque
Coatée avec un                 2 x 12 x 8                                     Contrôles
               12 x 8 puits                 B-CAL-MP Prête à l’emploi
Acm anti-                      puits                                          Marqueur
                                                                                                        Stables à 2-8 °C jusqu’à la date de péremption
calprotectine                                                                 enzymatique
Films adhésifs 3 pièces        6 pièces         -     Prête à l’emploi        Substrat TMB
Tampon de
                                                     A reconstituer           Solution stop
lavage
               1 flacon de     2 flacons de          avec 900 mL              Stop Solution
concentré 10x                               B-CAL-WB
               100 mL          100 mL                d’eau déionisée
Avec                                                                                                                                              Tableau 2
                                                     (chacun)
conservateurs

Revision date:    2018-04-10                                          18/60                                                    BÜHLMANN fCAL® ELISA
Next slide ... Cancel