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Research Collection Doctoral Thesis Micromechanical, Structural and Chemical Characterization of Transgenic Poplar Author(s): Özparpucu, Merve Publication Date: 2018 Permanent Link: https://doi.org/10.3929/ethz-b-000279139 This page was generated automatically upon download from the ETH Zurich Research Collection. For more information please consult the Terms of use. ETH Library
ETH zürich
Eidgenössische Technische Hochschule Zürich
Swiss Federal Institute of Technology Zürich
DISS. ETH NO: 24968
Micromechanical, Structural and Chemical
Characterization of Transgenic Poplar
A thesis submitted to attain the degree of
DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZÜRICH
(Dr. sc. ETH Zürich)
presented by
Merve Özparpucu
M.Sc., Anadolu University
born on 06/10/1985 in Eskişehir (Turkey)
citizen of Turkey
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. habil. Ingo Burgert, ETH Zurich, examiner
Prof. Dr. habil. Thomas Speck, University of Freiburg, co-examiner
Prof. Dr. habil. Wolfgang Gindl-Altmutter, University of Natural Resources and Life Sciences
(BOKU), co-examiner
2018ABSTRACT
Wood is a highly versatile and renewable material, which has retained great importance
throughout human history. It inherits excellent mechanical properties with regard to its light
weight, therefore, it performs well in a large number of structural applications. The macroscopic
mechanical properties of wood originate from its hierarchical organization on length scales in the
range of a few nanometers to meters.
Despite tremendous improvements in analytical techniques within the last decades, which have
provided a deeper knowledge of the structure of wood cell walls, the structure-property
relationships of wood have not been entirely revealed and understood. While cellulose is known
to act as the main load bearing element, the knowledge on the contribution of lignin to mechanical
properties is still limited. This thesis aims at better understanding the mechanical function of
lignin by utilizing lignin engineering and correlating the alterations in mechanical properties with
the altered structural and biochemical features of the cell walls.
In collaboration with the Department of Plant Biotechnology & Bioinformatics, University of
Ghent in the framework of the EU FP7 MultiBioPro Project, three different lignin engineered
poplar model systems were investigated for the structure-property analyses: two model systems
have a “Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase (CAD)” downregulation, which is achieved either by
antisense/sense (first model system: AS/S-CAD) or by hairpin-RNA-mediated silencing
approaches (second model system: hpCAD). The third model system was modified by
downregulation of “Caffeoyl Shikimate Esterase (CSE)” using hairpin-RNA-mediated silencing
approach (hpCSE). For investigating the mechanical properties, micromechanical tensile tests of
tissue strips were conducted. In order to elucidate changes in content and composition of lignin,
Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) and Raman analysis were performed, whereas the
orientation distribution of the cellulose microfibrils was determined by X-ray diffraction. The
entire analyses (except Raman spectroscopy) were done on the same mechanically tested tissue
strips.
The first analyzed model system (AS/S-CAD) represented slightly but significantly lower lignin
content based on the aromatic lignin absorbance measured by FTIR spectroscopy. Beside a
change in lignin content, an increase in incorporation of aldehydes into lignin was observed. In
the second model system (hpCAD), pronounced compositional changes were observed, whereas
lignin content was only slightly decreased. But due to high variability, lignin absorbance of the
transgenics was not significantly different than those of WT. A stronger increase in aldehyde
incorporation into lignin was found in hpCAD lines compared to AS/S-CAD. Additionally, severe
changes in S/G ratio were detected. The third model system (hpCSE) showed the most
ipronounced decrease in lignin content with slight alterations in lignin composition.
Micromechanical tensile tests showed that tensile stiffness decreased significantly in AS/S-CAD
(1st model system, a decrease of 16%) and hpCSE lines (3rd model system, a decrease of 35-50%).
The studies revealed that a decrease in lignin content led to a decrease in tensile elastic modulus.
A correlation with a coefficient of determination (R²) of 0.76 between lignin absorbance (as
measured in Infrared spectroscopy and taken as an indicator of lignin content) and tensile stiffness
was found for the combined results of biological replicates of AS/S-CAD and hpCSE modified
samples. The induced changes in lignin composition did not alter the mechanical properties as
revealed by the second model system: hpCAD. The modifications did neither or only marginally
alter the structure of polysaccharides (cellulose and hemicellulose) nor the orientation of the
cellulose microfibrils. Microfibril angles of around 15° (hpCSE) and 25° (both CAD model
systems) were revealed. The cellulose microfibril angle is one of the important parameters
determining the mechanical function of lignin. In the literature, it was suggested that the influence
of lignin on mechanical properties becomes more relevant in a cell wall with a rather large
cellulose microfibril angle. If cell walls with large MFA are loaded in tension, shear stresses
appear within the matrix. An increase in lignin content might then result in a higher tensile
modulus due to an increase of the shear stiffness of the matrix. The decrease in tensile modulus of
AS/S-CAD and hpCSE lines due the decrease in lignin content seems most likely to be as a result
of a large MFA of the cell wall. Nevertheless, MFA of hpCSE poplar was relatively lower
compared to MFA of AS/S-CAD lines. It is believed that this mechanism changes gradually with
a change in MFA. Yet, the mechanism of shear stiffening of the matrix by lignin has never been
shown at the molecular level. In this respect, simulation studies with appropriate cell wall models
may lead to further insight.
Besides this, lignin engineering may influence other chemical properties (e.g. crosslinking degree,
interaction between the cell wall polymers), but also structural (e.g. fibril length, and deviation in
fibril orientation) parameters which have not been analyzed for each individual model system.
Changes of such parameters might also influence the mechanical properties of the cell wall. For
this reason, the underlying mechanism, which leads to lower tensile stiffness with lower lignin
content is still far from being entirely understood. However, this thesis gives a novel contribution
towards understanding the mechanical role of lignin, as it revealed the influence of lignin content
on the tensile properties for the wood cell walls possessing MFA of 15ᵒ and above. Further
experimental investigations on genetically modified plants can lead to a better understanding of
the mechanical interactions of cell wall polymers in a broader context.
iiZUSAMMENFASSUNG
Holz stellt ein nachwachsendes und sehr vielfältig einsetzbares Material dar, dass quer durch die
Geschichte der Menschheit immer grosse Bedeutung hatte. Es hat exzellente mechanische
Eigenschaften, besonders auf das Gewicht bezogen, und es ist ein vorzügliches Material für viele
verschiedene strukturelle Anwendungen. Die makroskopischen mechanischen Eigenschaften
haben ihren Ursprung in der hierarchischen Struktur, die sich über mehrere Grössenordnungen
vom Nanometer- bis Meterbereich erstreckt.
Obwohl sich die Analytik in den letzten Jahrzehnten stark verbessert hat, was zu einer Aufklärung
der Zellwandstrukturen des Holzes geführt hat, sind eine ganze Reihe von Struktur-Eigenschafts-
beziehungen von Holz noch nicht verstanden. Während die Rolle der Zellulose als lasttragendes
Element aufgezeigt wurde, ist der Beitrag des Lignins zur Mechanik noch nicht aufgeklärt. Diese
Arbeit zielt darauf ab, zu einem besseren Verständnis der Funktion des Lignins in Bezug auf die
Zellwandmechanik beizutragen, indem es die Möglichkeiten der gezielten genetischen
Veränderung nutzt. Veränderungen der mechanischen Eigenschaften werden mit den Änderungen
in Gehalt und Zusammensetzung des Lignins korreliert.
Im Rahmen dieser Arbeit und in Zusammenarbeit mit der Abteilung Plant Biotechnology &
Bioinformatics der Universität Ghent in Belgien werden Pappeln auf ihre Struktur-
Eigenschaftsbeziehungen untersucht, die auf drei unterschiedliche Arten genetisch modifiziert
wurden. Es wurde mithilfe zweier unterschiedlicher Techniken eine (weitgehende) Inaktivierung
des Enzyms Cinnamyl Alkohol Dehydrogenase erzielt, zum einen durch die Sense/Antisense
Technik (AS/S-CAD Pappeln) zum anderen durch eine hairpin-RNA-basierte Technik (hpCAD
Pappeln). Im dritten Fall handelt es sich um Pappeln, deren Enzym Caffeoyl Shikimate Esterase
(CSE) ebenfalls durch die hairpin-RNA basierte Technik weitgehend inaktiviert wurde (hpCSE
Pappeln). Zur Analyse der mechanischen Eigenschaften wurden Mikrozugversuche an Streifen
des Xylemgewebes der Pappeln durchgeführt. Veränderungen im Gehalt und in der
Zusammensetzung des Lignins wurden mittels Infrarotspektroskopie und Ramanmikroskopie
analysiert, währende die Orientierungverteilung der Zellulosemikrofibrillen mittels
Röntgenbeugung untersucht wurde. Mit Ausnahme der Ramanmikroskopie, die an Querschnitten
der Pappelstämme durchgeführt wurde, wurde die gesamte Analyse an den mechanisch getesteten
Gewebestreifen durchgeführt.
Für die AS/S-CAD Pappeln wurde ein leichter, statistisch signifikanter Rückgang im Ligningehalt
im Vergleich zu den Wildtyppflanzen (WT) gemessen. Zusätzlich wurde eine Einlagerung von
Aldehyden der Ligninmonomere nachgewiesen. Für die hpCAD Pappeln ergab sich ein statistisch
nicht signifikanter Rückgang im Ligningehalt, jedoch waren Veränderungen in der
iiiLigninzusammensetzung stärker ausgeprägt als bei den AS/S-CAD Pappeln. Es zeigten sich ein
verstärkter Einbau der Aldehydemonomere im Lignin und Veränderungen im S/G-Verhältnis der
Ligninmonomere. Bei den hpCSE Pappeln ergab sich ein starker Rückgang im Ligningehalt
während die Ligninzusammensetzung nur geringfügig verändert war.
Die Mikrozugversuche ergaben, dass die Steifigkeit der AS/S-CAD Pappeln signifikant um 16%
reduziert war, während eine Verringerung des Elastizitätsmoduls um 35-50% in den hpCSE
Pappeln gegenüber dem WT gemessen wurde. Somit ergab sich eine Korrelation zwischen
Ligningehalt (abgeschätzt durch die Absorption im FTIR) und mechanischer Steifigkeit für diese
beiden Systeme mit einem Korrelationskoeffizient von 0.76. Für diese Berechnung wurden die
Mittelwerte der Absorption und der Steifigkeit der biologischen Replikate verwendet.
Veränderungen in der Ligninzusammensetzung hatten keinen Einfluss auf die mechanischen
Eigenschaften, wie die Ergebnisse der hpCAD Pappeln zeigten.
Es zeigten sich entweder keine oder nur kleine Veränderungen in der Struktur der Zellulose und
der Hemizellulosen, und die Orientierung der Zellulosemikrofibrillen blieb innerhalb der
unterschiedlichen Systeme gleich. Mikrofibrillenwinkel von 15° (hpCSE Pappeln) und 25° (CAD
Pappeln) wurden gemessen. Vorgängige Studien zeigten, dass der Mikrofibrillenwinkel einen
wichtigen Faktor darstellt, der die mechanischen Funktion des Lignins beeinflusst. In
vorangegangenen Studien wurde gezeigt, dass der Einfluss des Lignins auf die Zellwandmechanik
bei grösseren Mikrofibrillenwinkeln bedeutsamer ist. Wenn Zellwände mit einer derartigen
Zelluloseorientierung auf Zug belastet werden, treten Scherspannungen in der Matrix auf. Ein
erhöhter Ligningehalt kann dann zu einem höheren Zugelastizitätsmodul führen, hervorgerufen
durch einen höheren Schermodul der Matrix. Der Rückgang des Zugelastizitätsmoduls bei den
AS/S-CAD Pappeln und den hpCSE Pappeln, hervorgerufen durch den Rückgang im Ligningehalt
ist auf den grossen Mikrofibrillenwinkel zurückzuführen. Anhand der hpCSE Pappeln konnte hier
gezeigt werden, dass der Ligningehalt einen signifikanten Einfluss auf die Zugsteifigkeit bei
einem vergleichsweise kleinen Mikrofibrillenwinkel von 15° besitzt. Es ist anzunehmen, dass der
Einfluss des Ligningehalts auf die Mechanik sich graduell als Funktion des Mikrofibrillenwinkels
ändert. Der molekulare Mechanismus, der zu einer (angenommenen) Steigerung des Schermoduls
der Matrix führt, ist nicht bekannt. Hier könnten Simulationen mit geeigneten Modellen bessere
Einsicht bieten.
Die genetischen Veränderungen können auch noch zu weiteren Änderungen führen, wie z.B. zu
einer Änderung in der Vernetzungsdichte oder der Polymerinteraktionen. Weiterhin könnten sich
auch strukturelle Änderungen ergeben wie Änderungen in der Zelllänge oder in der Zellulose
Mikrofibrillenorientierung. Diese Parameter wurden in dieser Arbeit nicht bestimmt. Derartige
Änderungen könnten die mechanischen Eigenschaften der Zellwand bzw. des Gewebes ändern.
ivInsofern ist der zugrundeliegende Mechanismus, der bei einem reduzierten Ligningehalt zu einer
Änderung der mechanischen Eigenschaften führt noch nicht ganzheitlich aufgeklärt und
verstanden. Die vorliegende Arbeit zeigt jedoch einen neuen Beitrag zum Verständnis der Rolle
des Lignins für die Zellwandmechanik auf. Es wurde gezeigt, dass der Ligningehalt schon bei
Mikrofibrillenwinkeln von 15° oder einen Einfluss auf den Zugelastizitätsmodul hat. Für ein
besseres und breiteres Verständnis der Interaktion der Zellwandpolymere sind weitere
Untersuchungen an möglichst verschiedenen Systemen nötig.
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