BÜHLMANN fCAL ELISA Calprotectin ELISA assay
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BÜHLMANN fCAL ELISA ®
Calprotectin ELISA assay
For In Vitro Diagnostic Use.
EK-CAL2-WEX 192 tests
Release Date: 2019-12-20
Version A1
BÜHLMANN Laboratories AG English Page 2
Baselstrasse 55 Deutsch Seite 9
4124 Schönenbuch, Switzerland Français Page 17
Tel.: +41 61 487 1212 Italiano Pagina 25
Fax: +41 61 487 1234 Español Página 33
info@buhlmannlabs.ch Português Página 41Reagents Quantity Code Reconstitution
ENGLISH
Control Low /
High3)
INTENDED USE Serum-derived 2 vials B-CAL-
Ready to use
calprotectin in a x 1 mL CONSET
The BÜHLMANN fCAL®ELISA is an in vitro diagnostic buffer matrix with
test for the quantitative determination of calprotectin in preservatives
human stool specimens intended as an aid to the Enzyme Label
assessment of intestinal mucosal inflammation. The 2 vials
Anti-calprotectin B-CAL-EL Ready to use
assay results can be used as an aid to diagnosis in Ab conjugated to x 12 mL
distinguishing organic, inflammatory disease of the HRP
gastrointestinal tract (inflammatory bowel disease, IBD, TMB Substrate
specifically Crohn’s disease or ulcerative colitis, UC) from 2 vials
TMB in citrate B-TMB12 Ready to use
functional disease (irritable bowel syndrome, IBS) x 12 mL
buffer
(ref. 1-7), in patients with chronic abdominal pain and as Stop Solution
an aid to IBD disease monitoring (ref. 7-18). 2 vials
B-STS12
Ready to use
0.25 M sulfuric x 12 mL Corrosive agent
For laboratory use only. acid
Table 1
PRINCIPLE OF THE ASSAY
1)
The actual calprotectin concentration of the calibrators A to E are 4,
The BÜHLMANN fCAL® ELISA allows the selective 12, 40, 120 and 240 ng/mL, respectively. For the lower range ELISA
measurement of calprotectin in fecal extracts by procedure the calibrator values have to be set as: 10, 30, 100, 300
and 600 µg/g calprotectin. This assignement corresponds to the final
sandwich ELISA. The microtiter plate of the BÜHLMANN 1:2500 sample dilution in the lower range ELISA procedure.
fCAL® ELISA is coated with a monoclonal capture 2)
If you choose the extended range ELISA procedure the nominal
antibody (mAb) highly specific to the calprotectin calibrator values have to be set as: 30, 90, 300, 900 and 1800 µg/g
heterodimeric and polymeric complexes. Patient fecal calprotectin. This assignement corresponds to the final 1:7500
sample dilution in the extended range ELISA procedure.
sample extracts, controls for determination of ELISA run 3)
The controls contain lot specific amounts of native human
acceptability, and calibrators are loaded onto wells of the calprotectin. Refer to the additional QC data sheet for actual
microtiter plate. After a 30 minute incubation at room concentrations.
temperature and washing steps, a detection antibody
(Ab) conjugated to horseradish peroxidase (HRP) detects STORAGE AND STABILITY OF REAGENTS AND
the calprotectin molecules bound to the capture antibody WORKING SOLUTIONS
on the plate. After incubation and further washing steps,
the chromogenic HRP substrate, tetramethylbenzidine Sealed / unopened reagents
(TMB) is added (blue color formation) followed by a Store at 2-8 °C. Do not use the reagents beyond the expiration date
stopping reaction (change to yellow color). The printed on the labels.
absorption is measured at 450 nm. The final calprotectin Opened / reconstituted reagents
concentration in µg/g stool in the patient samples is Return unused strips immediately to the foil
determined using the calibration curve generated from Microtiter Plate
pouch containing the desiccant packs and
the measured calibrator values. reseal along the entire edge of zip-seal.
Store for up to 6 months at 2-8 °C.
REAGENTS SUPPLIED AND PREPARATION Diluted Wash Buffer
Incubation Buffer
Reagents Quantity Code Reconstitution
Calibrators
Microtiter Plate 2x Controls Store for up to 6 months at 2-8 °C.
precoated with 12 x 8 well
B-CAL-MP Ready to use Enzyme Label
anti-calprotectin strips
mAb with frame TMB Substrate
Plate Sealer 6 pieces - Ready to use Stop Solution
Wash Buffer Table 2
2 bottles Dilute each with
concentrate
B-CAL-WB 900 mL of deionized
(10x) with x 100 mL
preservatives
H2O REAGENTS AND MATERIALS SUPPLIED
SUPPLEMENTARY
Incubation
3 bottles
Buffer B-CAL-IB Ready to use Fecal extraction device
x 125 mL
with preservatives The fecal extraction device described in table 3 is not
Calibrators delivered with the kit and has to be ordered separately.
A to E1) 2)
Serum-derived 5 vials B-CAL- Extraction
Ready to use Quantity Code
calprotectin in a x 1 mL CASET Device Kit
buffer matrix with Packages of 50, 200 or 500
preservatives B-CALEX-C50
tubes available, each filled
CALEX Cap
®
B-CALEX-C200
with 5 mL extraction buffer
B-CALEX-C500
Ready to use
Table 3
Release date: 2019-12-20 2/56 BÜHLMANN fCAL® ELISAMATERIALS REQUIRED BUT NOT PROVIDED • Every effort should be made to ensure that no cross
contamination occurs between reagents, samples or
Extraction procedure
between wells.
• 100 µL and 1000 µL precision pipettes with
• Allow the reagents to equilibrate to room temperature.
disposable tips
Mix (vortex) the reagents well before use.
• Disposable polystyrene or polypropylene tubes for
• Microwells cannot be re-used.
transfer of extracts (optional)
• Laminar flow work station Extraction
• Multi tube vortex mixer / Vortex mixer • In order to receive reliable and quantitative results it is
important to homogenize the stool sample entirely in
• Micro centrifuge (≥3000 x g) the exctraction device. Insoluable (undigested)
• Centrifuge (≥500 x g) components may still be present after extraction.
ELISA procedure ELISA procedure
• 10 µL, 100 µL and 1000 µL precision pipettes with • In the ELISA procedure the washing steps are
disposable tips essential to guarantee reproducible results. Allow the
• Disposable polystyrene or polypropylene tubes for the wash buffer to incubate in the wells for a minimum of
preparation of sample dilutions 20 seconds before removing.
• 1000 mL cylinder for the dilution of the wash buffer • If an automated washer is used, “plate mode” is
strongly recommended, i.e. each process step
• Microtiter plate washer (see technical precautions) or
(dispense / aspiration) is carried out on all of the
squeeze bottle for wash buffer
strips, sequentially, before the instrument continues
• Microtiter plate shaker (see technical precautions) with the next washing cycle. Thus, the minimal
• Blotting paper incubation time is guaranteed.
• Microtiter plate reader for measurement of • The indicated number of washing cycles is mandatory
absorbance at 450 nm to ensure reproducible results.
• The plate shaker must be adjusted to approximately
WARNINGS AND PRECAUTIONS 450 rpm (7.5 Hz). Higher rotation frequency may
cause poor dilution linearity at values between
Safety precautions
300/900 and 600/1800 µg/g. A rotational movement
• The calibrators and controls of this test contain should be used instead of a horizontal movement.
components of human origin. Although tested and
• To ensure the antigen/antibody reaction is complete,
found negative for HBV surface antigen, HCV and
the incubation time in step 5 must be at least 30
HIV1/2 antibodies, the reagents should be handled as
minutes. Moderately longer incubation time (up to 5
if capable of transmitting infections and should be
minutes ) has no influence on the final outcome.
handled in accordance with Good Laboratory
Practices (GLP) using appropriate precautions. • The enzyme label is inactivated by oxygen and is
highly sensitive to sodium azide, thimerosal,
• The stop solution contains sulfuric acid (0.25 M). The
hypochlorous acid and aromatic chlorohydrocarbons
reagent is an irritant to eyes, skin and mucous
often found in laboratory water supplies. Therefore
membranes. Avoid contact with eyes, skin and
only deionized high quality water must be used.
clothes. After contact with eyes or skin, wash
immediately with plenty of water. • A new standard curve must be generated each time
the assay is performed (each plate or partial plate).
• Avoid contact of reagents with the skin, eyes or
mucous membranes. If contact does occur, • If the initial concentration of an unknown sample
immediately wash with generous amounts of water; reads above the concentration of the highest
otherwise, irritation / burns can occur. calibrator, calibrator E, the sample may be further
diluted with incubation buffer and assayed again
• Reagents and chemicals have to be treated as
according to the assay procedure. The resulting total
hazardous waste according to the national biohazard
dilution factor must be taken into account for the
safety guideline or regulation.
calculation of results.
Technical precautions
Kit components SPECIMEN COLLECTION AND STORAGE
• Residues in the microtiter plate wells result from the For the extraction procedure, less than 1 g of native stool
production process. They are removed in the washing specimen is required. Collect stool specimen into plain
step (assay procedure step 3) and do not affect the tubes.
results. Important: The specimen must be collected without any
• Components must not be used after the expiry date chemical or biological additives.
printed on the labels. Specimen transport
• Do not mix or use components from kits with different Stool specimens should be received for processing by
lot numbers. the laboratory within 3 days of collection. The specimens
may be transported at room temperature or refrigerated.
Release date: 2019-12-20 3/56 BÜHLMANN fCAL® ELISASpecimen storage
Stool specimens should be refrigerated at 2-8 °C and
extracted within 3 days of receipt at the laboratory. Do
not store samples at elevated temperatures.
STOOL SAMPLE EXTRACTION AND EXTRACT
STORAGE
1.1 Extraction procedure
Follow the instruction for use provided with the CALEX®
Cap device (Code B-CALEX-C50 / B-CALEX-C200 / B-
CALEX-C500).
1.` Sample dilution option 2:
Liquid stool samples can be pipetted directly into the Working range 30-1800 µg/g
CALEX® Cap device. Unscrew the blue cap and pipet 10 The working range can be extended by a factor of 3, if
µL of stool sample into the device. Recap the CALEX® you dilute the samples 1:7500 instead of 1:2500. This
Cap device and proceed with vortexing step according to procedure is recommended, if high calprotectin
the extraction procedure described and illustrated in the concentrations are to be expected.
instruction for use delivered with the CALEX® Cap
1.1` After extraction with the CALEX® Cap device, dilute
device.
the stool extracts 1:15 with incubation buffer (e.g.
Important: After extraction, centrifuge the CALEX® Cap 50 µL extract and 700 µL incubation buffer) and mix
device for 5 minutes at 500-3000 x g and continue with well. Let the samples equilibrate for at least 5
the assay procedure. minutes at 18-28 °C prior to proceeding to step 4c.
1.2 Extract storage
Fecal calprotectin extracts obtained with the CALEX®
Cap device are stable at room temperature for 3 days
and at 2-8°C for up to 6 days. For longer storage, freeze
extracts at -20°C. Frozen extracts are stable for a period
of up to 23 months.
CALEX® Cap extracts can be frozen directly and stored
within the CALEX® Cap device. Extracts can be subject
to four freeze-thaw cycles. Prior to measurement, allow
frozen extracts to equilibrate to room temperature, vortex
thoroughly for 10 seconds and centrifuge for 5 minutes at
500-3000 x g. 2. Prepare a plate frame with sufficient strips to test the
required number of calibrators, controls and diluted
WORKING RANGE samples. Remove excess strips from the frame and
re-seal them in the foil pouch together with the
The assay can be performed according to the following
desiccant packs without delay. Store refrigerated.
procedures: lower or extended range ELISA procedure.
The appropriate procedure should be selected depending 3. Wash the coated wells twice using at least 300 µL of
on the expected calprotectin concentration: wash buffer per well. Empty the wells and tap the
plate firmly onto blotting paper.
• For samples up to 600 µg/g calprotectin select lower
Important: Allow wash buffer to remain in the wells for a
range procedure (working range 10-600 µg/g).
minimum of 20 seconds during each wash step.
• If the samples tend to exceed 600 µg/g select the
extended range procedure (working range 30-
1800 µg/g).
ASSAY PROCEDURE
Important: Allow all reagents to equilibrate for at least 30
minutes to 18-28 °C prior to use. Only dilute stool
extracts. Calibrators and controls are ready to use.
1. Sample dilution option 1:
Working range 10-600 µg/g
1.1. After extraction with the CALEX® Cap device, dilute
the stool extracts 1:5 with incubation buffer (e.g.
4a. Pipet 100 µL of incubation buffer (blank) and
100 µL extract and 400 µL incubation buffer) and
mix well. Let the samples equilibrate for at least 5 Pipet 100 µL of calibrator A-E into the respective
minutes at 18-28 °C prior to proceeding to step 4c. wells.
4b. Pipet 100 µL of the controls low and high into the
respective wells.
4c. Pipet 100 µL of each diluted sample into the
subsequent wells.
Release date: 2019-12-20 4/56 BÜHLMANN fCAL® ELISA5. Cover the plate with a plate sealer, and incubate for
30 + max. 5 min on a plate shaker set to ~450 rpm at
18-28 °C (see technical precautions – ELISA
procedure).
6. Remove and discard the plate sealer. Empty the wells
and wash three times using at least 300 µL of wash
buffer per well (see technical precautions – ELISA
procedure). Empty the wells and tap the plate firmly
onto blotting paper.
QUALITY CONTROL
Thorough understanding of this instruction for use is
necessary for the successful use of the product. Reliable
results will be obtained only by precise laboratory
techniques and accurately following this instruction for
use.
The BÜHLMANN fCAL® ELISA kit comes with two
controls: controls low and high. The corresponding
reference values of the controls are stated in the QC data
sheet provided with each kit. The values and ranges
7. Pipet 100 µL of enzyme label to all wells. stated on the QC data sheet always refer to the current
8. Cover the plate with a plate sealer, and incubate for kit lot and should be used for direct comparison of the
results. Should the results for the controls low and/or
30 ±5 min on a plate shaker set to ~450 rpm at 18-
high be out of the range stated in the QC data sheet, it is
28 °C.
recommended to consider the whole run as invalid.
9. Remove and discard the plate sealer. Empty the wells
It is recommended to use internal control samples, in
and wash five times using at least 300 µL of wash
addition to kit controls, according to local and national
buffer per well. Empty the wells and tap the plate
regulations. The use of internal control samples is
firmly onto blotting paper.
advised to assure the day to day validity of results. Since
there is no control for fecal calprotectin commercially
available, we recommend using a pool of stool extracts
with normal and pathological levels for internal quality
control.
The reproducibility of standard curve parameters and
control values should be within established limits of
laboratory acceptability. If the performance of the assay
does not meet the established limits and repetition has
excluded errors in technique, check the following issues:
i) pipetting, temperature controlling and timing devices; ii)
Important: Allow the TMB substrate solution to equilibrate
ELISA reader settings; iii) expiration dates of reagents;
to 18-28 °C.
iv) storage and incubation conditions; v) TMB substrate
10. Pipet 100 µL of the TMB substrate solution to all solution should be colorless; vi) purity of water; vii)
wells. aspiration and washing methods.
11. Cover the plate with a plate sealer, protect the plate
from direct light and incubate for 15 ±2 min on a plate STANDARDIZATION
shaker set to ~450 rpm at 18-28 °C.
The BÜHLMANN fCAL® ELISA calibrator values are
assigned in multiple measurement runs using internal
reference material based on human serum and the
BÜHLMANN fCAL® ELISA measurement procedure. The
calprotectin concentration of the internal reference
material was established using purified MRP8/14 from
human granulocytes as primary reference material.
CALCULATION OF TEST RESULTS
Standard curve
12. Pipet 100 µL of stop solution to all wells. Remove air It is recommended to use a software program capable of
bubbles with a pipette tip. Proceed to step 13 within the following calculations; subtract the blank OD value
30 min. from each calibrator well to calculate the calibrator value.
13. Read the absorbance at 450 nm in a microtiter plate Establish a standard curve using a 4 parameter logistic
reader. (4 PL) fit.
Release date: 2019-12-20 5/56 BÜHLMANN fCAL® ELISAControls and Samples Clinical thresholds
It is recommended to use a software program capable of Results from 58 clinical samples from patients diagnosed
the following calculations; subtract the blank OD value with IBS and 131 clinical samples from patients
from each control/ sample well. Calculate the calprotectin diagnosed with IBD, from an international clinical study,
concentration of the control/ sample in each well, in µg/g, were analyzed to obtain the values described in table 4.
using the established standard curve.
Calprotectin
Interpretation Follow-up
Working range 10-600 µg/g concentration
If you select the lower range ELISA procedure, the < 80 µg/g Normal None
calibrator concentrations have to be set as: 10, 30, 100, Follow-up within 4 – 6
80 – 160 µg/g Gray-zone/Borderline
300 and 600 µg/g calprotectin. Additional dilution factors weeks
(if using a different final dilution than 1:2500) have to be > 160 µg/g Elevated Repeat as needed
multiplied with the results to obtain the final results. Table 4
Refer to table 12 and figure 1 for typical data (results and
Calprotectin values below 80 μg/g
standard curve). These results and standard curve are
provided for demonstration purposes only. A standard Fecal calprotectin values 160 µg/g are indicative of
LIMITATIONS neutrophil infiltrate in the gastrointestinal tract; therefore,
• Reagents delivered with the BÜHLMANN fCAL® this may signal the presence of active inflammatory
ELISA kit are intended for the determination of disease. Appropriate further investigative procedures by
calprotectin levels in human stool samples only. specialists are suggested to achieve an overall clinical
diagnosis.
• Test results should be interpreted in conjunction with
information available from clinical assessment of the Clinical evaluation
patient and other diagnostic procedures. The ability of the BÜHLMANN fCAL® ELISA to
• For IBD disease monitoring, multiple fecal calprotectin discriminate between patients with IBD and other non-
measurements performed at up to 4 weeks intervals inflammatory GI disorders, including IBS, was tested in a
have been suggested to have best diagnostic clinical study with a total of 337 adult and pediatric
accuracy in predicting clinical relapse in patients patients. One hundred and thirty five (135) patients had a
(ref. 19-20). final diagnosis of IBD (Crohn’s disease, ulcerative colitis
• Some patients taking non-steroidal anti-inflammatory or indeterminate colitis), 130 patients suffered from IBS
drugs (NSAID) will have elevations in their fecal and 72 patients presented with abdominal pain and/or
calprotectin levels. diarrhea, or other GI-related non-inflammatory conditions
(refer to table 5). Final diagnosis was supported by
• Results may not be clinically applicable to children endoscopic as well as other clinical findings.
less than 4 years of age who have mildly increased
fecal calprotectin levels (ref. 21-24). A clinical sensitivity of 93.3% at 80 µg/g and a clinical
specificity of 83.7% at 160 µg/g, can be reached in the
differentiation between IBD and GI-related non-
INTERPRETATION OF RESULTS
inflammatory conditions, including IBS. ROC curve
I. Distinguishing organic disease from functional analysis resulted in an AUC of 0.923 (refer to table 6).
gastrointestinal disease A clinical sensitivity of 93.3% at 80 µg/g and a clinical
The result categories are based on data from clinical specificity of 85.4% at 160 µg/g, can be reached in the
studies performed by BÜHLMANN and are differentiation between IBD and IBS. ROC curve analysis
BÜHLMANN’s recommendations. All test results should resulted in an AUC of 0.933 (refer to table 8).
be interpreted in conjunction with information available The optimal cut-off combination for these patient pools
from the patient’s clinical symptoms, medical history, and could be defined by ROC analysis at 80 µg/g and
other clinical and laboratory findings. 160 µg/g calprotectin, which is slightly more stringent
than a combination of a more sensitive lower cut-off of
50 µg/g with lower performance in specificity, and an
Release date: 2019-12-20 6/56 BÜHLMANN fCAL® ELISAupper cut-off of 200 µg/g with slightly lower sensitivity Limit of Quantitation (LoQ): 9.8 µg/g
(table 7 and 9). Forty determinations of ten stool samples with values
between 5.2 and 1254 µg/g were performed to generate
II. IBD monitoring a non-linear precision profile and establish a LoQ based
Clinical thresholds and evaluation on a precision goal of 20 % CV. Precise measurementsLimit of Quantitation (LoQ): 21.3 µg/g INTERFERING SUBSTANCES
The LoQ was established according to the CLSI
The susceptibility of the BÜHLMANN fCAL® ELISA assay
guideline EP17-A2, based on 60 determinations and a
to oral pharmaceuticals, nutritional supplements,
precision goal of 20 % CV.
hemoglobin as well as entheropathological
Linearity: 30-1800 µg/g microorganisms was assessed according to the CLSI
The linear range of the BÜHLMANN fCAL® ELISA was guideline EP07-A2, using the extended working range.
determined according to the CLSI guideline EP06-A. A Bias in results exceeding 10% was considered as
maximum deviation from linearity of ±20 % was allowed. interference. No interference was detected with
For values below 75 µg/g an absolute difference of less substances, listed in table 25, up to the indicated
than ±15 µg/g was allowed (table 20). concentrations. No interference was detected with
entheropathological microorganisms, listed in table 26,
Accuracy / Recovery: 96.4 – 102.2% up to the indicated amounts of colony forming units
Seven stool specimen extracts with calprotectin levels (CFU) per mL of stool specimen extract.
spanning the measuring range of the test were spiked
with 180 μg/g calprotectin in calibrator material. Spiking
was performed at 10 % the specimen extract volume.
“Baseline” samples were spiked with the corresponding
amount of incubation buffer. “Baseline” and “baseline +
spike” samples were measured in three replicates with
one reagent lot. The results are presented in table 21.
Preanalytics
The performance characteristics of the BÜHLMANN
fCAL® ELISA with regard to preanalytical procedures was
established using the working range 30 – 1800 µg/g.
Extraction reproducibility – CALEX® Cap: 7.9 - 16.9%
Extraction reproducibility was established according to
the CLSI guideline EP05-A3 using a 3 CALEX® Cap lots
x 4 extractions x 4 replicates study design. Five clinical
stool samples, including solid, semi-solid and liquid
sample consistency, were tested. The values are
presented in table 22.
Method comparison CALEX® Cap vs. manual
extraction
Bias at 80 μg/g: 5.9% (95% CI: 1.4 - 12.2%)
Bias at 160 μg/g: 12.0% (95% CI: 7.8 – 17.0%)
Mean Bias: 10.1% (95% CI: 5.7 – 14.5%)
The method comparison study was performed according
to the CLSI guideline EP09-A3. Two hundred forty one
(241) clinical samples were extracted with one lot of the
CALEX® Cap device. Reference values were established
in extracts obtained with the manual extraction method.
In total, 172 samples within the measuring range of the
BÜHLMANN fCAL® ELISA and a reference calprotectin
concentration interval of 30.5 – 1496.6 µg/g were
assessed. Single extractions and assay determinations
were performed for both methods. Bias was determined
using Passing-Bablok linear regression and Bland-
Altman analysis (tables 23 and 24).
Release date: 2019-12-20 8/56 BÜHLMANN fCAL® ELISADEUTSCH Reagenzien Menge Code
Rekonsti-
tution
Kalibratoren
VERWENDUNGSZWECK
A-E1) 2)
Der BÜHLMANN fCAL® ELISA ist ein in-vitro- Aus Serum
gewonnenes 5 Fläschchen Gebrauchs-
Diagnosetest für die quantitative Bestimmung von B-CAL-CASET
Calprotectin in einer x 1 mL fertig
Calprotectin in humanen Stuhlproben, der als Hilfsmittel Puffermatrix
bei der Beurteilung von Darmschleimhautentzündungen mit Konservierungs-
dient. Die Testergebnisse dienen bei der Diagnose als mittel
Hilfsmittel zur Unterscheidung zwischen organischen, Kontrolle tief /
entzündlichen Erkrankungen des Magen-Darm-Traktes hoch3)
(entzündliche Darmerkrankungen (CED), speziell Morbus Aus Serum 2 Fläschchen B-CAL- Gebrauchs-
gewonnenes
Crohn oder Colitis ulcerosa (UC)) und funktionellen x 1 mL CONSET fertig
Calprotectin in einer
Erkrankungen (Reizdarmsyndrom (RDS)) (Ref. 1-7) bei Puffermatrix mit
Patienten mit chronischen Bauchschmerzen und als Konservierungs-mittel
Hilfsmittel bei der Überwachung der CED (Ref. 7-18). Enzymmarker
2 Fläschchen Gebrauchs-
Nur für den Laborgebrauch. anti-Calprotectin Ak
x 12 ml
B-CAL-EL
fertig
konjugiert mit HRP
TESTPRINZIP TMB-Substrat 2 Fläschchen Gebrauchs-
B-TMB12
TMB in Citratpuffer x 12 mL fertig
Der BÜHLMANN fCAL®
ELISA ermöglicht die selektive
Messung von Calprotectin in Stuhlprobenextrakten mit Stopp-Lösung Gebrauchs-
2 Fläschchen fertig
dem Sandwich-ELISA. Die Mikrotiterplatte des 0,25 M
x 12 mL
B-STS12
korrosives
BÜHLMANN fCAL® ELISA ist mit einem monoklonalen Schwefelsäure
Agens
Fängerantikörper (mAb) beschichtet, der hochspezifisch
Tabelle 1
für heterodimeren und polymeren Calprotectinkomplexe
ist. Stuhlprobenextrakte von Patienten, Kontrollen zur
1)
Die tatsächliche Konzentrationen der Kalibratoren A-E betragen 4,
12, 40, 120 und 240 ng/mL Calprotectin. Für die „Lower Range“
Bestimmung der ELISA Messakzeptanz und Kalibratoren ELISA Variante müssen die Kalibratorwerte wie folgt eingestellt
werden in die Wells der Mikrotiterplatte gegeben. Nach werden: 10, 30, 100, 300 und 600 µg/g Calprotectin. Diese
einer 30-minütigen Inkubationszeit bei Raumtemperatur Verwendung entspricht einer Probenendverdünnung von 1:2500 in
und nach den Waschschritten bindet ein der „Lower Range“ ELISA Variante.
2)
Wenn Sie die „Extended Range“ ELISA Variante verwenden, müssen
Detektionsantikörper (Ak), der an Meerrettichperoxidase die nominalen Kalibratorwerte wie folgt eingestellt werden: 30, 90,
(HRP) konjugiert ist, an die Caplprotectinmoleküle, die 300, 900 und 1800 µg/g Calprotectin. Diese Verwendung entspricht
wiederum an die Fängerantikörper auf der Platte einer Probenendverdünnung von 1:7500 in der „Extended Range“
gebunden sind. Nach der Inkubation und weiteren ELISA Variante.
3)
Die Kontrollen enthalten chargenspezifische Mengen von nativem,
Waschschritten wird das chromogene HRP-Substrat humanem Calprotectin. Die tatsächlichen Konzentrationen werden
Tetramethylbenzidin (TMB) hinzugefügt (Bildung einer auf dem zusätzlichen QC Datenblatt angegeben
blauen Farbe); danach wird die Reaktion gestoppt
(Farbumschlag nach gelb). Die Absorption wird bei 450 LAGERUNG UND STABILITÄT DER REAGENZIEN
nm gemessen. Die endgültige Calprotectinkonzentration UND ARBEITSLÖSUNGEN
in µg/g Stuhl in den Patientenproben wird mithilfe der
Kalibrierkurve ermittelt, die anhand der gemessenen Verschlossene / ungeöffnete Reagenzien
Kalibratorwerte erstellt worden ist. Bei 2-8 °C lagern. Die Reagenzien nicht über das Verfallsdatum
hinaus verwenden, das auf den Etiketten aufgedruckt ist.
GELIEFERTE REAGENZIEN UND VORBEREITUNG Geöffnete / rekonstituierte Reagenzien
Ungebrauchte Streifen sofort in den Folienbeutel
Rekonsti-
Reagenzien Menge Code mit den Trockenmittelpackungen zurücklegen und
tution
Mikrotiterplatte den Druckleistenverschluss entlang der ganzen
Mikrotiterplatte 2x Leiste wieder verschliessen.
12 x 8-Well Gebrauchs- Bei 2-8 ˚C bis zu 6 Monate lagern.
mit anti-Calprotectin B-CAL-MP
mAK vorbeschichtet Streifen fertig
Verdünnter
mit Halter Waschpuffer
Gebrauchs- Inkubationspuffer
Abdeckfolie 6 Stück -
fertig
Kalibratoren
Waschpuffer- Jede mit Bei 2-8 ˚C bis zu 6 Monate lagern.
900 mL Kontrollen
konzentrat (10x) 2 Flaschen
B-CAL-WB deionisiertem Enzymmarker
mit Konservierungs- x 100 mL
mittel H2O
verdünnen TMB-Substrat
Inkubationspuffer Stopp-Lösung
3 Flaschen Gebrauchs-
mit Konservierungs- B-CAL-IB Tabelle 2
x 125 mL fertig
mittel
Release date: 2019-12-20 9/56 BÜHLMANN fCAL® ELISAZUSÄTZLICH ERHÄLTLICHE REAGENZIEN UND • Kontakt der Reagenzien mit der Haut, den Augen
MATERIALIEN oder den Schleimhäuten vermeiden. Im Falle eines
Kontaktes sofort mit reichlich Wasser spülen,
Extraktionsprodukt für Stuhlproben ansonsten kann eine Reizung oder Verätzungen
Das Extraktionsprodukt zur Stuhlextraktion in Tabelle 3 auftreten.
wird nicht mit dem Kit mitgeliefert und muss zusätzlich
zum Kit bestellt werden. • Die Reagenzien und Chemikalien müssen gemäss
den nationalen Richtlinien und Bestimmungen als
Extraktions-
Menge Code gefährlicher Abfall behandelt werden.
produkt Kit
Technische Vorsichtsmassnahmen
Packungen zu 50, 200 oder
500 Röhrchen, jedes mit B-CALEX-C50
Kit-Komponenten
CALEX® Cap 5 mL Extraktionspuffer B-CALEX-C200
gefüllt B-CALEX-C500 • Auf Grund des Produktionsprozesses kann es
Gebrauchsfertig Rückstände in den Wells der Mikrotiterplatten geben.
Tabelle 3 Sie werden im Waschschritt (Testdurchführung Schritt
3) entfernt und haben keinen Einfluss auf die
ERFORDERLICHE NICHT IM LIEFERUMFANG Ergebnisse.
ENTHALTENE MATERIALIEN • Die Komponenten dürfen nach Ablauf des auf den
Extraktion Etiketten aufgedruckten Verfallsdatums nicht mehr
verwendet werden.
• 100 µL und 1000 µL Präzisionspipetten mit
Einwegspitzen • Komponenten von Kits mit verschiedenen
Chargennummern nicht mischen oder verwenden.
• Polystyrol- oder Polypropyleneinwegröhrchen zum
Überführen der Extrakte (bei Bedarf) • Vermeiden Sie unter allen Umständen, dass es zu
Kontaminationen zwischen verschiedenen
• Laminar Flow Arbeitsplatz
Reagenzien, Proben und zwischen den Wells kommt.
• Multiröhrchen-Vortexmischer / Vortexmischer
• Die Reagenzien vor Gebrauch auf Raumtemperatur
• Mikrozentrifuge (≥3000 x g) äquilibrieren lassen. Die Reagenzien vor dem
• Zentrifuge (≥500 x g) Gebrauch gut mischen (vortexen).
ELISA • Mikrotiterstreifen dürfen nicht wiederverwendet
werden.
• 10 µL, 100 µL und 1000 µL Präzisionspipetten mit
Einwegpipettenspitzen Extraktion
• Polystyrol- oder Polypropyleneinwegröhrchen zur • Um verlässliche, quantitative Resultate zu erhalten, ist
Durchführung der Probenverdünnungen es wichtig, dass die im Extraktionsröhrchen
• 1000 ml Messzylinder zur Verdünnung des enthaltene Stuhlprobe vollständig homogenisiert wird.
Waschpuffers Unlösliche (unverdaute) Bestandteile können auch
nach der Extraktion verhanden sein.
• Mikrotiterplattenwaschautomat (siehe technische
Vorsichtsmassnahmen) oder Spritzflasche für ELISA
Waschpuffer • Bei der Durchführung des ELISA sind die
• Mikrotiterplattenschüttler (siehe technische Waschschritte essentiell, um reproduzierbare
Vorsichtsmassnahmen) Resultate zu garantieren. Eine minimale
Inkubationszeit des Waschpuffers im Well von
• Fliesspapier
mindestens 20 Sekunden muss vor dem Entfernen
• Mikrotiterplattenphotometer zur Messung der eingehalten werden.
Absorption bei 450 nm
• Wird ein Waschautomat eingesetzt, wird dringend
angeraten den „Platten- Modus“ auszuwählen. Das
WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN heisst, dass jeder Schritt (Einfüllen / Absaugen) erst
Sicherheitsmassnahmen über die gesamte Platte ausgeführt wird, bevor mit
• Die Kalibratoren und Kontrollen dieses Tests dem nächsten Waschschritt fortgefahren wird. Somit
enthalten Bestandteile humanen Ursprungs. Obwohl kann die minimale Inkubationszeit gewährleistet
sie negativ in Tests für HBV Oberflächenantigen, HCV werden.
und HIV1/2 Antikörper waren, sollten sie gemäss • Die angegebene Anzahl von Waschschritten muss
guter Laborpraxis (GLP) als potentiell infektiös dringend eingehalten werden, um reproduzierbare
behandelt werden und die entsprechenden Resultate zu gewährleisten.
Sicherheits-vorkehrungen getroffen werden.
• Der Plattenschüttler muss auf ca. 450 U/min (7,5 Hz)
• Die Stopp-Lösung enthält Schwefelsäure (0,25 M). eingestellt sein. Eine höhere Rotations-
Das Reagenz reizt die Augen, Haut und geschwindigkeit kann zu einer schlechteren
Schleimhäute. Kontakt mit Augen, Haut und Kleidung Verdünnungslinearität bei Werten zwischen 300/900
vermeiden. Bei Berührung mit den Augen oder der und 600/1800 µg/g führen. Eine Rotationsbewegung
Haut sofort mit viel Wasser abwaschen. sollte einer Horizontalbewegung vorgezogen werden.
Release date: 2019-12-20 10/56 BÜHLMANN fCAL® ELISA• Damit die Antigen-Antikörper-Reaktion vollständig und bei 2-8 °C bis zu 6 Tage stabil. Bei längerer
ablaufen kann, muss die Inkubationszeit in Schritt 5 Lagerung, die Extrakte bei -20 °C einfrieren. Gefrorene
mindestens 30 Minuten betragen. Leicht längere Extrakte sind für einen Zeitraum von bis zu 23 Monaten
Inkubationszeiten (bis zu 5 Minuten) zeigen keinen stabil.
Einfluss auf das Endresultat. CALEX® Cap Extrakte können direkt gefroren und im
CALEX® Cap gelagert werden. Die Extrakte können vier
• Der Enzymmarker wird durch Sauerstoff inaktiviert
Einfrier/Auftau-Zyklen ausgesetzt werden. Vor der
und ist sehr empfindlich gegen Natriumazid,
Messung die gefrorenen Extrakte auf Raumtemperatur
Thimerosal, Hypochlorsäure und aromatische
äquilibrieren lassen, 10 Sekunden gründlich vortexen
chlorierte Kohlenwasserstoffe, die oft in der Wasser-
und 5 Minuten bei 500 - 3000 x g zentrifugieren.
versorgung des Labors vorkommen. Daher sollte nur
deionisiertes von hoher Qualität verwendet werden.
MESSBEREICH
• Die Standardkurve muss bei jedem Test (jeder
Mikrotiterplatte oder partiellen Mikrotiterplatte) neu Der Test kann gemäss der „Lower Range“ oder der
erstellt werden. „Extended Range“ ELISA Variante durchgeführt werden.
Die geeignete Variante sollte je nach der erwarteten
• Falls die Anfangskonzentration einer unbekannten Calprotectinkonzentration ausgewählt werden:
Probe grösser als diejenige des höchsten Kalibrators
(E) ist, kann diese Probe mit Inkubationspuffer weiter • Bei Proben bis zu 600 µg/g Calprotectin sollte die
verdünnt und erneut gemäss der Testdurchführung „Lower Range“ Variante (Messbereich 10-600 µg/g)
gemessen werden. Der resultierende Gesamt- ausgewählt werden.
verdünnungsfaktor muss bei der Berechnung der • Falls die Proben 600 µg/g häufig überschreiten, sollte
Ergebnisse berücksichtigt werden. die „Extended Range“ Variante (Messbereich 30-
1800 µg/g) ausgewählt werden.
PROBENENTNAHME UND LAGERUNG
Für das Extraktionsverfahren werden weniger als 1 g TESTDURCHFÜHRUNG
native Stuhlprobe benötigt. Die Stuhlproben in Röhrchen Wichtiger Hinweis: Die Reagenzien vor dem Gebrauch
ohne Zusatzstoffe füllen. mindestens 30 Minuten auf 18-28 °C äquilibrieren lassen.
Wichtiger Hinweis: Den Proben dürfen keine chemische Nur die Stuhlextrakte verdünnen. Kalibratoren und
oder biologische Zusatzstoffe beigefügt werden. Kontrollen sind gebrauchsfertig.
Transport der Proben 1. Option 1 für die Probenverdünnung:
Messbereich 10-600 µg/g
Die Stuhlproben sollten innerhalb von 3 Tagen nach der
Gewinnung zur Bearbeitung im Labor eingehen. Die 1.1 Nach der Extraktion mit dem CALEX® Cap werden
Stuhlproben können bei Raumtemperatur oder gekühlt die Stuhlextrakte 1:5 mit Inkubationspuffer verdünnt
versendet werden. (z. B. 100 µL Extrakt und 400 µL Inkubationspuffer)
und gut gemischt. Vor Gebrauch in Schritt 4c, die
Lagerung der Proben Proben für mindestens 5 Minuten bei 18-28 °C
Die Stuhlproben sollten im Kühlschrank bei 2-8 °C äquilibrieren lassen.
aufbewahrt und innerhalb von 3 Tagen nach Eingang im
Labor extrahiert werden. Die Proben nicht bei erhöhten
Temperaturen lagern.
EXTRAKTION DER STUHLPROBEN UND
LAGERUNG DER EXTRAKTE
1.1 Extraktion
Die Gebrauchsanweisung beachten, die dem CALEX®
Cap (Code B-CALEX-C50 / B-CALEX-C200 / B-CALEX-
C500) beigelegt ist.
Flüssige Stuhlproben können direkt in das CALEX® Cap
pipettiert werden. Die blaue Kappe abschrauben und
10 µL der Stuhlprobe in das Röhrchen pipettieren. Die 1.` Option 2 für die Probenverdünnung:
Kappe des CALEX® Cap wieder aufschrauben und mit Messbereich 30-1800 µg/g
dem Vortex-Schritt gemäss dem Extraktionsverfahren, Der Messbereich kann um einen Faktor von 3 erweitert
das in der mit dem CALEX® Cap mitgelieferten werden, wenn die Proben 1:7500 statt 1:2500 verdünnt
Gebrauchsanweisung beschrieben und abgebildet ist, werden. Diese Testversion wird empfohlen, wenn hohe
fortfahren. Calprotectinkonzentrationen zu erwarten sind.
Wichtiger Hinweis: Nach der Extraktion wird das CALEX® 1.1` Nach der Extraktion mit dem CALEX® Cap werden
Cap 5 Minuten bei 500-3000 x g zentrifugiert. Danach mit die Stuhlextrakte 1:15 mit Inkubationspuffer
der Testdurchführung fortfahren. verdünnt (z. B. 50 µL Extrakt und 700 µL
Inkubationspuffer) und gut gemischt. Vor Gebrauch
1.2 Lagerung der Extrakte in Schritt 4c, die Proben für mindestens 5 Minuten
Fäkales Calprotectin in Extrakten, die mit dem CALEX® bei 18-28 °C äquilibrieren lassen.
Cap gewonnen wurden, ist bei Raumtemperatur 3 Tage
Release date: 2019-12-20 11/56 BÜHLMANN fCAL® ELISA7. 100 µL des Enzymmarkers in jedes Well pipettieren.
8. Mikrotiterplatte mit einer Folie abdecken und auf
einem Mikrotiterplattenschüttler bei ~450 U/min 30 ±5
Minuten bei 18-28 °C inkubieren.
2. Einen Mikrotiterplattenhalter mit ausreichender Menge
an Streifen für die Bestimmung der erforderlichen 9. Abdeckfolie entfernen und entsorgen. Die Wells
Anzahl von Kalibratoren, Kontrollen und verdünnten entleeren und 5 x mit jeweils mindestens 300 µL
Proben vorbereiten. Ungebrauchte Streifen vom Waschpuffer waschen. Waschpuffer ausschütten und
Halter entfernen und sofort in den Folienbeutel mit Platte fest auf Blottingpapier ausklopfen.
den Trockenmittelpackungen zurücklegen und den
Beutel wieder verschliessen. Gekühlt lagern.
3. Die beschichteten Wells zweimal mit jeweils
mindestens 300 µL Waschpuffer waschen.
Waschpuffer ausschütten und Platte fest auf
Blottingpapier ausklopfen.
Wichtiger Hinweis: Eine minimale Inkubationszeit des
Waschpuffers im Well von 20 Sekunden muss bei jedem
Waschschritt eingehalten werden. Wichtiger Hinweis: TMB-Substrat vor dem Gebrauch auf
18-28 °C äquilibrieren lassen.
10. 100 µL des TMB-Substrats in jedes Well pipettieren.
11. Mikrotiterplatte mit einer Folie abdecken und auf
einem Mikrotiterplattenschüttler bei ~450 U/min 15 ±2
Minuten bei 18-28 °C inkubieren. Platte vor direktem
Licht schützen.
4a. 100 µL Inkubationspuffer (Leerprobe) und
Je 100 µL Kalibrator A-E in die entsprechenden Wells
pipettieren.
4b. Je 100 µL der Kontrollen tief und hoch in die
entsprechenden Wells pipettieren.
4c. Je 100 µL der verdünnten Proben in die nächsten
12. 100 µL der Stopp-Lösung in jedes Well pipettieren.
Wells pipettieren.
Vorhandene Luftbläschen mit einer Pipettenspitze
5. Mikrotiterplatte mit einer Folie abdecken und auf entfernen. Innerhalb der nächsten 30 Minuten mit
einem Mikrotiterplattenschüttler bei ~450 U/min Schritt 13 fortfahren.
30 + max. 5 Minuten bei 18-28 °C inkubieren (siehe
13. Absorption in einem Mikrotiterplattenphotometer bei
technische Vorsichtsmassnahmen - ELISA).
450 nm messen.
6. Abdeckfolie entfernen und entsorgen. Die Wells
entleeren und 3 x mit jeweils mind. 300 µL
Waschpuffer waschen (siehe technische
Vorsichtsmassnahmen - ELISA). Waschpuffer
ausschütten und Platte fest auf Blottingpapier
ausklopfen
Release date: 2019-12-20 12/56 BÜHLMANN fCAL® ELISAQUALITÄTSKONTROLLE Berechnen der Calprotectinkonzentrationen der
Kontrollen und Proben in jedem Well mithilfe der
Für den erfolgreichen Einsatz des Produktes ist eine ermittelten Standardkurve in µg/g berechnen.
gründliche Kenntnis der Gebrauchsanweisung
notwendig. Zuverlässige Resultate werden nur durch die Messbereich 10-600 µg/g
Anwendung präziser Labormethoden und die genaue Wenn die „Lower Range“ ELISA Variante ausgewählt
Befolgung der Gebrauchsanweisung erreicht. wird, müssen die Kalibratorkonzentrationen wie folgt
Das BÜHLMANN fCAL® ELISA Kit wird mit zwei eingestellt werden: 10, 30, 100, 300 und 600 µg/g
Kontrollen geliefert: Kontrolle, tief und hoch. Die Calprotectin. Zusätzliche Verdünnungsfaktoren (bei
entsprechenden Referenzwerte der Kontrollen sind im Verwendung einer anderen Verdünnung als 1:2500)
QC-Datenblatt, das jedem Kit beiliegt, angegeben. Die müssen für den Erhalt der endgültigen Ergebnisse mit
auf dem QC-Datenblatt angegebenen Werte und den Ergebnissen multipliziert werden.
Bereiche beziehen sich stets auf die aktuelle Kitcharge In Tabelle 12 und Abbildung 1 sind Beispiele für
und sollten für den direkten Vergleich der Ergebnisse Ergebnisse und die Standardkurve angegeben. Diese
verwendet werden. Sollten die Ergebnisse der Kontrollen Ergebnisse und die Standardkurve sind nur als Beispiel
tief und/oder hoch ausserhalb des im QC-Datenblatt gedacht. Für jeden Probensatz, der getestet werden soll,
angegebenen Bereichs liegen, wird empfohlen, den muss eine Standardkurve erstellt werden.
ganzen Test als ungültig anzusehen.
Messbereich 30-1800 µg/g
Es wird empfohlen, neben den Kitkontrollen auch interne Wenn die „Extended Range“ ELISA Variante ausgewählt
Kontrollproben gemäss örtlicher und nationaler wird, müssen die nominalen Kalibratorwerte wie folgt
Bestimmungen zu verwenden. Die Verwendung von eingestellt werden: 30, 90, 300, 900 und 1800 µg/g
internen Kontrollproben wird empfohlen, um die Calprotectin. Zusätzliche Verdünnungsfaktoren (bei
Gültigkeit der Ergebnisse von Tag zu Tag zu Verwendung einer anderen Verdünnung als 1:7500)
gewährleisten. Da es keine kommerziell erhältlichen müssen für den Erhalt der endgültigen Ergebnisse mit
Kontrollen für fäkales Calprotectin gibt, wird empfohlen, den Ergebnissen multipliziert werden.
einen Pool von positiven Stuhlextrakten mit normalen In Tabelle 15 und Abbildung 4 sind Beispiele für
und pathologischen Konzentrationen als interne Ergebnisse und die Standardkurve angegeben. Diese
Qualitätskontrolle mitzuführen Ergebnisse und die Standardkurve sind nur als Beispiel
Die Reproduzierbarkeit der Standardkurvenparameter gedacht. Für jeden Probensatz, der getestet werden soll,
und Kontrollwerte sollte innerhalb gängiger muss eine Standardkurve erstellt werden.
Laborakzeptanzgrenzwerte liegen. Falls die Ergebnisse
des Testes nicht innerhalb der erwarteten Bereiche LEISTUNGSEINSCHRÄNKUNGEN
liegen und wiederholte Messungen einen
Durchführungsfehler ausschliessen, sind folgende • Die mit dem BÜHLMANN fCAL® ELISA Kit
Punkte zu überprüfen: i) Pipettieren, Temperaturkontrolle bereitgestellten Reagenzien sind nur für die
und Zeitmesser, ii) Einstellungen des ELISA Bestimmung der Calprotectinkonzentrationen in
Photometers, iii) Verfallsdaten der Reagenzien, iv) humanen Stuhlproben vorgesehen.
Lagerung- und Inkubationsbedingungen, v) das TMB- • Die Testergebnisse sollten zusammen mit
Substrat sollte farblos sein, vi) Wasserreinheit; vii) Informationen, die aus der klinischen Beurteilung des
Absauge- und Waschmethoden. Patienten und anderer diagnostischer Verfahren
verfügbar sind, interpretiert werden.
STANDARDISIERUNG • Bei der CED-Überwachung gibt es Hinweise, dass
Die BÜHLMANN fCAL® ELISA Kalibratorwerte werden in mehrfache Messungen von Calprotectin im Stuhl, die
mehrfachen Messdurchgängen mithilfe von internem in bis zu 4-wöchigen Zeitabständen durchgeführt
Referenzmaterial berechnet, das auf Humanserum und werden, die höchste diagnostische Genauigkeit bei
dem BÜHLMANN fCAL® ELISA Messverfahren basiert. der Vorhersage eines klinischen Rezidivs bei
Die Calprotectinkonzentration des internen Patienten haben (Ref. 19-20).
Referenzmaterials wurde mithilfe von gereinigtem • Patienten, die nichtsteroidale Entzündungshemmer
MRP8/14 aus humanen Granulozyten als primäres (NSAIDs) einnehmen, haben möglicherweise erhöhte
Referenzmaterial ermittelt. Calprotectinkonzentrationen im Stuhl.
• Die Ergebnisse sind unter Umständen nicht klinisch
BERECHNUNG UND ERGEBNISSE anwendbar auf Kinder unter 4 Jahren, die leicht
Standardkurve erhöhte Calprotectinspiegel im Stuhl aufweisen
(Ref. 21-24).
Es wird ein Softwareprogramm empfohlen, das die
folgenden Berechnungen ausführen kann; Abzug des OD
Leerwerts von jedem Kalibrator-Well zur Berechnung des INTERPRETATION DER ERGEBNISSE
Kalibratorwerts und die Anpassung der Standardkurve I. Unterscheiden einer organischen Erkrankung
mithilfe einer 4 Parameter Logistik (4 PL). von einer funktionellen gastrointestinalen
Kontrollen und Proben Erkrankung
Es wird ein Softwareprogramm empfohlen, das die Die Ergebniskategorien basieren auf Daten aus
folgenden Berechnungen ausführen kann; Abzug des OD klinischen Studien, die von BÜHLMANN durchgeführt
Leerwerts von jedem Kontroll- und Proben-Well und wurden, und sind Empfehlungen von BÜHLMANN. Alle
Release date: 2019-12-20 13/56 BÜHLMANN fCAL® ELISATestergebnisse sollten zusammen mit Informationen, die Die Differenzierung zwischen CED und GI-assoziierten
aus den klinischen Symptomen des Patienten, der nichtentzündlichen Erkrankungen einschliesslich RDS
Anamnese und anderen klinischen Ergebnissen und wurde mit einer klinischen Empfindlichkeit von 93,3% bei
Laborbefunden verfügbar sind, interpretiert werden: 80 µg/g und einer klinischen Spezifität von 83,7% bei
160 µg/g erreicht. Die ROC-Kurvenanalyse ergab einen
Klinische Schwellenwerte
AUC von 0,923 (siehe Tabelle 6).
Ergebnisse aus 58 klinischen Proben von mit RDS
Die Differenzierung zwischen CED und RDS wurde mit
diagnostizierten Patienten und aus 131 klinischen
Proben von mit CED diagnostizierten Patienten aus einer einer klinischen Empfindlichkeit von 93,3% bei 80 µg/g
und einer klinischen Spezifität von 85,4% bei 160 µg/g
internationalen klinischen Studie wurden herangezogen,
um die in Tabelle 4 angegebenen Werte zu erhalten. erreicht. Die ROC-Kurvenanalyse ergab einen AUC von
0,933 (siehe Tabelle 8).
Calprotectin- Die durch ROC-Analyse definierte optimale Kombination
Interpretation Nachuntersuchung
konzentration
von Toleranzgrenzen für diese Patientenpopulationen
< 80 µg/g Normal Keine betrug 80 µg/g und 160 µg/g Calprotectin, welches etwas
Nachbeobachtung stringenter ist als die Kombination einer empfindlicheren
80 – 160 µg/g Grauzone/grenzwertig innerhalb 4 – 6 unteren Toleranzgrenze von 50 µg/g mit geringerer
Wochen Spezifitätsleistung und einer oberen Toleranzgrenze
> 160 µg/g Erhöht
Nach Bedarf von 200 µg/g mit etwas geringerer Empfindlichkeit
wiederholen
(Tabelle 7 und 9).
Tabelle 4
II. CED-Überwachung
Calprotectinwerte unterhalb 80 μg/g
Calprotectinwerte im Stuhl 160 µg/g deuten auf eine
individuelle Patienten-Schwellenwerte durch Bestimmung
neutrophile Infiltration des gastrointestinalen Traktes hin;
des Calprotectin-Spiegelausgangswerts des Patienten
daher kann dies ein Zeichen dafür sein, dass eine aktive
während der Krankheitsremission festlegen:
entzündliche Erkrankung vorliegt. Entsprechende
weiterführende Untersuchungen durch Fachärzte zur Calprotectinwerte unterhalb 100 µg/g:
Erhaltung einer klinischen Gesamtdiagnose werden Calprotectin-Spiegel im Stuhl unterhalb 100 µg/g können
empfohlen. Patienten mit niedrigem Risiko eines klinischem Rezidivs
Klinische Beurteilung in endoskopischer Remission verlässlich identifizieren.
Invasive endoskopische Verfahren können bei diesen
Die Fähigkeit des BÜHLMANN fCAL® ELISA zwischen
Patienten vermieden werden (Ref. 7-18).
Patienten mit CED und anderen nichtentzündlichen GI-
Erkrankungen einschliesslich RDS zu unterscheiden, Calprotectinwerte zwischen 100 und 300 µg/g:
wurde in einer klinischen Studie mit insgesamt 337 Calprotectin-Spiegel im Stuhl von 100 bis 300 µg/g
erwachsenen und pädiatrischen Patienten untersucht. können auf die Notwendigkeit einer engmaschigeren
Einhundertfünfunddreissig (135) Patienten hatten die Überwachung im folgenden Zeitraum hinweisen, um
endgültige Diagnose einer CED (Morbus Crohn, Colitis Tendenzen der Krankheitsentwicklung zu beurteilen.
ulcerosa oder unklare Colitis), 130 Patienten hatten RDS
und 72 Patienten stellten sich mit Bauchschmerzen Calprotectinwerte oberhalb 300 µg/g:
und/oder Durchfall bzw. anderen GI-assoziierten Bei Calprotectinspiegeln im Stuhl von über 300 µg/g
nichtentzündlichen Erkrankungen vor (siehe Tabelle 5). sollte die Bestimmung wiederholt und bei Bestätigung
Die endgültige Diagnose wurde durch Endoskopie sowie erhöhter Spiegel weitere Untersuchungsverfahren
andere klinische Befunde gestützt. veranlasst werden (Ref. 7-18).
Release date: 2019-12-20 14/56 BÜHLMANN fCAL® ELISALEISTUNGSMERKMALE sieben gepoolte Stuhlprobenextrakte untersucht
(Tabelle 16).
Die Leistungsmerkmale des BÜHLMANN fCAL®
ELISA
wurden mit der manuellen Extraktionsmethode ermittelt, Präzision zwischen verschiedenen Chargen:
soweit nicht anders angegeben. 4,2 – 9,7% VK
Messbereich: 10-600 µg/g Die Charge zu Charge Reproduzierbarkeit wurde
gemäss CLSI-Leitlinie EP05-A3 mit dem Studiendesign 3
Wiederholbarkeit (Intra-Test-Präzision):
1,9 – 8,0% VK Chargen x 5 Tage x 5 Replikate ermittelt. Sechs
extrahierte Stuhlproben wurden analysiert. Für die
Laborinterne Präzision: 5,5 – 14,0% VK
Datenanalyse wurde ein Random-Effects-
Die Wiederholbarkeit und laborinterne Präzision wurde Varianzkomponenten-Modell verwendet. Die Werte sind
gemäss CLSI-Richtlinie EP05-A2 mit dem Studiendesign in Tabelle 17 aufgeführt.
22 Tage x 2 Replikate ermittelt. Zehn extrahierte
Stuhlproben wurden getestet. Die Werte sind in Tabelle Reproduzierbarkeit (Präzisionsbeurteilungsstudie an
13 aufgeführt. mehreren Standorten): 6,4 – 19.0% VK
Die Reproduzierbarkeit wurde gemäss CLSI-Leitlinie
Nachweisgrenze (LoD): 4,2 μg/g
EP05-A3 mit dem Studiendesign 3 Standorte x 2
Die LoD wurde gemäss CLSI-Richtlinie EP17-A ermittelt Bediener x 5 Tage x 2 Läufe x 4 Replikate ermittelt. Bei
und mit Anteilen von weniger als 5% falsch-positiven (α) den zwei täglich durchgeführten Läufen wechselten die
und weniger als 5% falsch-negativen (β) basierend auf Bediener zwischen zwei verschiedenen ELISA-
240 Bestimmungen, mit 80 Leerproben- Photometern und zwei verschiedenen Reagenzchargen.
(Extraktionspuffer) und 160 Niedrigspiegel-Replikaten; Es wurden insgesamt drei Reagenzchargen in den
und einem LoB von 0,29 µg/g. Eine kubische Spline- Studienstandorten verwendet. Es wurden fünf gepoolte
Funktion wurde verwendet, um die OD-Werte der Stuhlprobenextrakte getestet (Tabelle 18 und 19).
Leerproben auf die Calprotectinkonzentrationen in μg/g
zu extrapolieren. Nachweisgrenze (LoD): 12,6 μg/g
Die LoD wurde gemäss CLSI-Richtlinie EP17-A2 ermittelt
Bestimmungsgrenze (LoQ): 9,8 μg/g
und mit Anteilen von weniger als 5 % falsch-positiven (α)
Vierzig Bestimmungen von zehn Stuhlproben mit Werten und weniger als 5 % falsch-negativen (β) basierend auf
zwischen 5,2 und 1254 µg/g wurden durchgeführt, um 120 Bestimmungen, mit 60 Leerproben-
ein nicht-lineares Präzisionsprofil zu erstellen und eine (Extraktionspuffer) und 60 Niedrigspiegel-Replikaten; und
LoQ basierend auf einem Präzisionsziel von 20% VK zu einem LoB von 8,3 µg/g.
ermitteln. Im gesamten Standardbereich von 10 bis
600 µg/g wurden genaue MessungenReproduzierbarkeit der Extraktion – CALEX® Cap: 7,9 – 16,9% Die Reproduzierbarkeit der Extraktion wurde gemäss CLSI-Richtlinie EP05-A3 mit dem Studiendesign 3 CALEX® Cap Chargen x 4 Extraktionen x 4 Replikate ermittelt. Fünf klinische Stuhlproben, einschliesslich Proben mit fester, halbfester und flüssiger Konsistenz, wurden getestet. Die Werte sind in Tabelle 22 aufgeführt. Methodenvergleich CALEX® Cap vs. manuelle Extraktion Abweichung bei 80 μg/g: 5,9% (95% KI: 1,4 – 12,2%) Abweichung bei 160 μg/g: 12,0% (95% KI: 7,8 – 17,0%) Durchschnittliche Abweichung 10,1% (95% KI: 5,7 – 14,5%) Die Methodenvergleichsstudie wurde gemäss CLSI- Leitlinie EP09-A3 durchgeführt. Zweihundert- einundvierzig (241) klinische Proben wurden mit einer Charge des CALEX® Cap extrahiert. Die Referenzwerte wurden in Extrakten ermittelt, die mit der manuellen Extraktionsmethode gewonnen wurden. Insgesamt 172 Proben im Messbereich des BÜHLMANN fCAL® ELISA und einem Calprotectin-Referenzkonzentrationsinterval von 30,5 – 1496,6 µg/g wurden bewertet. Einzelextraktionen und Testbestimmungen wurden mit beiden Methoden durchgeführt. Die Verzerrung wurde mithilfe der linearen Regression nach Passing-Bablok und der Bland-Altman-Analyse bestimmt (Tabellen 23 und 24). STÖRSUBSTANZEN Die Anfälligkeit des BÜHLMANN fCAL® ELISA Tests für oral anwendbare Pharmazeutika, Nahrungs- ergänzungsmittel, Hämoglobin sowie enteropathologische Mikroorganismen wurde gemäss CLSI-Richtlinie EP07-A2 mit einem erweiterten Messbereich beurteilt. Eine Verzerrung der Ergebnisse höher als 10 % wurde als Störeinfluss betrachtet. Es wurde kein Störeinfluss der in Tabelle 25 aufgeführten Substanzen bis zu den angegebenen Konzentrationen nachgewiesen. Es wurde kein Störeinfluss der in Tabelle 26 aufgeführten enteropathologischen Mikroorganismen bis zu den angegebenen Mengen an koloniebildenden Einheiten (KBE) pro mL Stuhlprobenextrakt nach- gewiesen. Release date: 2019-12-20 16/56 BÜHLMANN fCAL® ELISA
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